白芍總苷輔助治療SLE對患者外周血CD4+CD25+T細胞表達的影響*

鐘益萍，米向斌，張?zhí)玫?，孫樂棟

(南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院皮膚科,廣州 510282)

白芍總苷輔助治療SLE對患者外周血CD4+CD25+T細胞表達的影響*

鐘益萍，米向斌，張?zhí)玫拢瑢O樂棟△

(南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院皮膚科,廣州 510282)

目的 探討白芍總苷(TGP)輔助治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)對患者外周血CD4+CD25+T細胞表達水平的影響。方法 采用流式細胞術(shù)檢測健康對照組、常規(guī)組、TGP組外周血CD4+CD25+T細胞比率。結(jié)果 SLE患者CD4+CD25+T細胞表達率為(6.15±1.21)%，健康對照組CD4+CD25+T細胞表達率為(12.30±1.78)%?；顒悠赟LE患者與健康對照組CD4+CD25+T細胞表達率比較，差異有統(tǒng)計學意義(t=22.03，P<0.05 )；常規(guī)組治療前后外周血CD4+CD25+T細胞的表達水平差異有統(tǒng)計學意義(t=-12.30，P<0.05)；TGP組治療前后外周血CD4+CD25+T細胞的表達水平差異也有統(tǒng)計學意義(t=-16.68，P<0.05)。常規(guī)組外周血CD4+CD25+T細胞的表達水平為(9.34±1.37)%，TGP組外周血CD4+CD25+T細胞的表達水平為(11.49±1.14)%，兩組差異有統(tǒng)計學意義(t=-6.46,P<0.05 )。結(jié)論 活動期SLE患者CD4+CD25+T細胞表達率水平顯著低于健康對照組；SLE患者經(jīng)過TGP輔助治療后CD4+CD25+T細胞表達率顯著提高。TGP治療可能作用于CD4+CD25+T細胞。

紅斑狼瘡，系統(tǒng)性；流式細胞術(shù)；CD4+CD25+T細胞；白芍總苷

Abstract:Objective to investigate the effect of TGP assisted treatment of SLE on the expression of CD4+CD25+T in patient peripheral blood.Methods flow cytometry was used to detect the peripheral blood CD4+CD25+T cells in healthy group,routine group and TGP group.Results The expression rate of CD4+CD25+T cells in SLE patients was (6.15±1.21)%,and that of the healthy controls was (12.30±1.78)%.The expression rate of CD4+CD25+T cells in active SLE patients and healthy controls were significantly different (t=22.03,P<0.05).In the routine group,the expression rate of peripheral blood CD4+CD25+T cells before and after treatment were significantly different (t=12.30,P<0.05);in the TGP group,the expression rate of peripheral blood CD4+CD25+T cells before and after treatment were significantly different,too (t=16.68,P<0.05).The expression rate of peripheral blood CD4+CD25+T cells in routine group and TGP group were (9.34±1.37)% and (11.49±1.14)% respectively,and the difference was statistically significant (t=6.46,P<0.05).Conclusion The expression rate of CD4+CD25+T cells in active SLE patients was significantly lower than that of healthy controls;the expression rate of CD4+CD25+T cells in SLE patients increased significantly after treatment.The TGP treatment may work on CD4+CD25+T cells.

目前，CD4+CD25+T細胞在系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)中的發(fā)病機制越來越受關(guān)注，且發(fā)現(xiàn)CD4+CD25+T細胞在疾病發(fā)展中數(shù)量降低及功能下降[1-2]。有研究表明，CD4+CD25+T細胞在機體中能控制自身免疫反應和維持免疫耐受；且CD4+CD25+T細胞控制機體損傷后的免疫反應，即如果機體內(nèi)CD4+CD25+T細胞缺失可能將導致SLE發(fā)生[3]。臨床治療SLE中，在使用糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑的基礎上加用白芍總苷(TGP)可顯著減少激素的用量及降低不良反應[4-9]。然而,TGP治療SLE的詳細機制目前仍不清。因此，對TGP輔助治療SLE的研究有重要意義。

目前，關(guān)于CD4+CD25+T細胞在SLE患者中的研究較多，但關(guān)于TGP對SLE患者外周血CD4+CD25+T細胞比率變化的影響研究則報道相對較少。因此，本研究探討TGP治療SLE時對CD4+CD25+T細胞的調(diào)控作用，探討TGP治療SLE的免疫學機制，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2012年3月至2013年9月本院皮膚科就診的活動期SLE患者60例，其中男4例，女56例，年齡18～49歲，平均32歲。分為常規(guī)組(30例)，TGP組(30例)。診斷標準嚴格按照美國風濕病學院1997年修訂的SLE分類標準執(zhí)行。按SLE病情活動程度的評價根據(jù)美國SLE疾病活動指數(shù)評分(SLEDAI)選取活動期患者(≥6分)。同時選取60例本院健康體檢者為對照組。全部患者均無哮喘 、蕁麻疹、濕疹、糖尿病、炎癥性腸病和其他風濕病[10]。2組間性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 儀器與試劑 藻紅蛋白(PE)標記的鼠抗人CD25+單克隆抗體 (IgG2a/PE)、異硫氰熒光素(FITC)標記的鼠抗人CD4+單克隆抗體(IgG2b/FITC)、同型對照鼠 IgG2b/FITC、鼠IgG2a/PE(深圳晶美有限公司)；FACS Calibur型流式細胞儀(美國Becton Dickinson公司儀器)[11]。

1.3 方法

1.3.1 病例采集 晨起空腹抗凝管管抽取靜脈血2 mL,離心取血清標本，抗凝血100 μL，室溫放置30 min后立即送檢。

1.3.2 治療方法 兩組患者均用潑尼松聯(lián)合環(huán)磷酰胺治療,劑量和方法參考2010版中華醫(yī)學會風濕病分會系統(tǒng)性紅斑狼瘡診斷及治療指南。潑尼松的用量為0.5～1.0 mg·kg-1·d-1,治療6周后,周用量每周減少5 mg,至30 mg/d。如治療過程中出現(xiàn)病情復發(fā)或加重情況,恢復糖皮質(zhì)激素使用劑量至0.5～1.0 mg/kg。環(huán)磷酰胺(CYC)沖擊療法：CYC 0.50～0.75 g/m2體表面積+生理鹽水100 mL,1 h 內(nèi)快速靜脈滴注。如治療過程中出現(xiàn)復發(fā)或病情加重等情況,則縮短CYC沖擊時間。TGP組患者在此基礎上加用TGP治療(劑量為0.6 g，2次/d)，療程60 d。所有患者于第1、60天抽取晨起空腹外周靜脈血。

1.3.3 臨床觀察指標 患者臨床表現(xiàn)(發(fā)熱、新發(fā)皮疹、口腔潰瘍、關(guān)節(jié)炎、脫發(fā)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害)、實驗室檢查(血常規(guī)、尿常規(guī)、大便常規(guī)，補體、抗雙鏈DNA抗體、抗核抗體、抗Sm抗體、心臟彩超、腹部彩超、肺部CT)[10]。

1.3.4 CD4+CD25+T細胞百分率的檢測 標本分兩管流式管：檢測管和同型對照管。取乙二胺四乙酸 (EDTA)抗凝的SLE患者外周血100 μL，分別放入各流式管內(nèi)。檢測管加入IgG2b及 IgG2a，同型對照管加人鼠IgG2b/FITC及鼠 IgG2a/PE各10 μL，輕輕混勻。室溫避光20 min后，加人紅細胞裂解液 2 mL，振蕩混勻后避光至 10 min。1 000 r/min離心 5 min，棄上清液，加入磷酸鹽緩沖液(PBS)懸浮細胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，再用PBS沖洗1次，離心棄上清液，加入0.3 mL PBS懸浮細胞，室溫避光10 min后上機使用光源 488 nm 的氬激光，上機前先用標準微球進行光路和流路的校正，使變異系數(shù)(CV)在 2%以下。用同型對照確定熒光陰性范圍，根據(jù)細胞的前向角散射光(FSC)和側(cè)向角散射光(SSC)特性初步圈取淋巴細胞群門，每份標本中測定淋巴細胞群門中10 000個淋巴細胞中CD4+CD25+T細胞的百分率,實驗步驟參照文獻[11]。

2 結(jié) 果

2.1 SLE患者外周血CD4+CD25+T細胞的表達水平 SLE患者治療前和健康對照組外周血CD4+CD25+T細胞的表達水平為(6.15±1.21)%和(12.30±1.78)%。其中SLE患者治療前外周血CD4+CD25+T細胞的表達水平低于健康對照組，差異有統(tǒng)計學意義(t=22.03,P<0.05)，見圖1。

*:P<0.05，與健康組比較。

圖1 外周血CD4+CD25+T細胞的表達水平的比較

2.2 SLE患者經(jīng)2種方案治療后外周血CD4+CD25+T細胞的表達水平 常規(guī)組治療前后CD4+CD25+T細胞表達率分為(6.15±0.94)%、(9.38±1.37)%，二者差異有統(tǒng)計學意義(t=-12.30，P<0.05)；TGP組治療前后CD4+CD25+T細胞表達率分為(6.15±1.45)%、(11.49±1.14)%，二者差異也有統(tǒng)計學意義(t=-16.68，P<0.05)；常規(guī)組與TGP組治療后CD4+CD25+T細胞表達率比較，差異有統(tǒng)計學意義(t=-6.46,P<0.05 )，見圖2。

*:t=-6.46,P<0.05，與TGP組治療后比較。

圖2 外周血CD4+CD25+T細胞的表達水平比較

3 討 論

SLE作為一個重要的系統(tǒng)性自身免疫疾病，主要表現(xiàn)為自身反應性T細胞和B細胞的活化，以及致病性自身抗體的產(chǎn)生。大量研究顯示，自身免疫性疾病的易感和誘發(fā)與CD4+CD25+T細胞的數(shù)量降低或功能減退存在著重要相關(guān)性[12-13]。其中也包括SLE的具體發(fā)生原因。CD4+CD25+T在機體免疫體系中所發(fā)揮的作用主要體現(xiàn)在自身免疫耐受，同時對外來抗原保持一定的應答活性[14]。其功能主要為:通過釋放抑制性細胞因子，抑制T細胞對自身抗原的免疫應答，進而抑制其細胞的活化對自身組織的損害。除了對效應T細胞的影響外，CD4+CD25+T細胞還可抑制炎癥細胞及其產(chǎn)生的相關(guān)炎癥因子(TNF-α、IFN-γ、IL-6)和調(diào)節(jié)因子(IL-10)以減輕機體組織損傷[13]。這一過程對維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)具有重要意義，主要體現(xiàn)在預防自身免疫性疾病的發(fā)生及誘導移植耐受等[15-17]。

本研究中，對各60例活動期SLE患者及健康人抽取外周血，測定CD4+CD25+T細胞比率水平，結(jié)果顯示活動期SLE患者外周血中CD4+CD25+T細胞表達率明顯低于健康人。通過對治療后穩(wěn)定的SLE患者進行檢查發(fā)現(xiàn)，外周血CD4+CD25+T細胞的表達率升高但仍低于健康對照組。結(jié)論進一步證實SLE患者的發(fā)病過程與CD4+CD25+T細胞水平之間存在的相關(guān)性[10-11，18]。即 CD4+CD25+T細胞水平的下降會導致T、B淋巴細胞激活，產(chǎn)生多種自身抗體，最終造成多器官損傷[19]。

臨床上對SLE的治療，常規(guī)以糖皮質(zhì)激素和環(huán)磷酰胺為主。在改善患者病情的同時伴隨著一定的藥物不良反應的發(fā)生，如糖皮質(zhì)激素長期、大量使用易引起感染、消化道潰瘍、骨壞死等嚴重并發(fā)癥；此外，環(huán)磷酰胺長期使用，則會引起肝毒性等不良反應[20]。因此，在保證SLE患者藥物治療有效性的同時如何最大程度地降低不良反應是臨床醫(yī)師所面臨的重要問題。針對這一問題，國內(nèi)部分學者通過使用TGP進行聯(lián)合輔助治療，臨床發(fā)現(xiàn)激素及免疫抑制劑的使用劑量降低且不良反應得到改善[21-22]。

本試驗在常規(guī)用藥治療的基礎上結(jié)合使用TGP進行輔助治療，比較常規(guī)組與TGP組間的CD4+CD25+T細胞水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn),TGP輔助治療60 d后,其CD4+CD25+T細胞數(shù)量較治療前顯著上升,并且要高于常規(guī)組水平。這一變化趨勢同疾病的具體臨床表現(xiàn)變化一致。表明TGP對SLE的治療作用機制之一是上調(diào)CD4+CD25+T細胞數(shù)量,從而抑制各種免疫反應。但其具體機制尚不甚清楚，有待進一步研究。

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The effect of TGP assisted treatment of SLE on the expression of CD4+CD25+T in patient peripheral blood*

ZhongYiping,MiXiangbin,ZhangTangde,SunLedong△

(DepartmentofDermatology,theAffiliatedZhujiangHospitalofSouthernMedicalUniversity,Guangzhou,Guangdong510282,China)

lupus erythematosus,systemic;flow cytometry;CD4+CD25+T cells;TGP

國家自然科學基金青年資助項目(81201233)。 作者簡介：鐘益萍(1987-)，碩士，主要從事系統(tǒng)性紅斑狼瘡，激光美容?！?/p>

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R751

A

1671-8348(2014)32-4311-03

2014-07-13

2014-09-02)

論著·臨床研究