腺相關(guān)病毒載體用于外傷性視神經(jīng)損傷基因治療的研究進(jìn)展△

吳國(guó)玖 查旭 張遠(yuǎn)平 曹霞 馬林昆

視神經(jīng)是由視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cells，RGC)的軸突在鞏膜篩孔處匯聚向后延伸形成。外傷性視神經(jīng)損傷(traumatic optic nerve injury，TONI)常導(dǎo)致嚴(yán)重視力下降或盲，以往多種藥物及手術(shù)治療也難見(jiàn)成效。2001年 Acland等［1］用重組腺相關(guān)病毒(recombination adeno-associated virus，rAAV)載體編碼RPE65可使先天性利伯氏黑蒙病狗恢復(fù)視覺(jué)功能，從此激發(fā)人們對(duì)轉(zhuǎn)基因治療視神經(jīng)疾病的極大興趣?；蛑委熗ǔＪ峭ㄟ^(guò)載體將目的基因即治療基因?qū)氚屑?xì)胞，通過(guò)表達(dá)產(chǎn)物從而達(dá)到治療目的。已證實(shí)腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus vector，AAV)載體具有轉(zhuǎn)染效率高、免疫原性低、無(wú)毒性、長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)等優(yōu)點(diǎn)［2］，是目前最常用的轉(zhuǎn)基因治療載體。TONI基因治療最常用的研究模型是哺乳動(dòng)物視神經(jīng)橫斷或擠壓傷，與臨床的視神經(jīng)外傷相似。本文就近年來(lái)關(guān)于視神經(jīng)損傷后微環(huán)境變化及應(yīng)用AAV載體基因治療TONI的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 視神經(jīng)損傷與RGC凋亡

1.1 視神經(jīng)損傷后微環(huán)境變化 視神經(jīng)損傷后，神經(jīng)結(jié)構(gòu)和周邊微環(huán)境遭到破壞，細(xì)胞軸突離斷、水腫、死亡，同時(shí)也出現(xiàn)一些不利因素，如自由基形成、RGC 內(nèi)超氧化物增加［3］、過(guò)氧化物陰離子增加［4］、谷氨酸鹽的毒性作用、K+門(mén)控通道 KV1家族出現(xiàn)［5］、caspase-6 及 caspase-8 上 調(diào)［6］、caspase-2 激活［7］、JNK 信號(hào)通路激活［8］、軸突殘端有毒物質(zhì)滲漏、硫苷脂增加［9］等，這些因素均不利于視神經(jīng)修復(fù)。同時(shí)，視神經(jīng)損傷后因自身固有的修復(fù)能力會(huì)產(chǎn)生一些有利視神經(jīng)修復(fù)的因素，如自我吞噬功能上調(diào)以保護(hù)神經(jīng)元存活［10］、再生RGC中上調(diào)的晶狀體蛋白β2通過(guò)增強(qiáng)睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的產(chǎn)生而促進(jìn)軸突再生［11］、睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子在星型膠質(zhì)細(xì)胞的顯著表達(dá)［12］和胸腺素-β4 上調(diào)［13］均增強(qiáng) RGC 存活和促進(jìn)軸突再生等，此外尚有許多不為所知的影響因素有待發(fā)現(xiàn)。

1.2 RGC死亡、凋亡特點(diǎn) 視神經(jīng)損傷后周邊微環(huán)境變得不穩(wěn)定使RGC漸漸死亡。成年哺乳動(dòng)物視神經(jīng)損傷存在延時(shí)現(xiàn)象，即視神經(jīng)損傷后3 d才能發(fā)現(xiàn)RGC死亡，RGC程序性死亡相關(guān)改變可能在傷后6 h已經(jīng)開(kāi)始［14］，RGC死亡高峰在視神經(jīng)損傷后5～9 d，在損傷 2周后有 10%～15%的 RGC存活［15］。凋亡是一種繼發(fā)性死亡形式，RGC凋亡高峰出現(xiàn)在傷后3個(gè)月［16］，直至傷后6個(gè)月仍可見(jiàn)RGC凋亡［17］。因此，視神經(jīng)損傷后及時(shí)增強(qiáng)RGC生存能力和促進(jìn)其軸突再生是治療的關(guān)鍵。

2 AAV載體

2.1 AAV載體生物學(xué)特點(diǎn) 野生型 AAV屬于微小病毒科，是依賴病毒類(lèi)的一種。AAV為無(wú)包膜單鏈DNA，外有衣殼蛋白包裹，是動(dòng)物病毒中最小的病毒［18］。AAV載體基因組長(zhǎng)約4.6 kb，包括2個(gè)開(kāi)放閱讀框—rep和cap，兩端各有一個(gè)末端反向重復(fù)序列(inverted terminal repeat，ITR)，在保留 ITR 的前提下，AAV載體的rep及cap基因由外源性基因表達(dá)框替代，經(jīng)修飾后形成 rAAV載體。自身互補(bǔ)型rAAV 載體(self-complementary rAAV，ScrAAV)也是在AAV載體的基礎(chǔ)上改良而成，rAAV載體和ScrAAV載體一個(gè)共同點(diǎn)是兩者都含雙鏈基因組。

2.2 AAV載體的血清型及其在眼部轉(zhuǎn)染特點(diǎn) 目前，來(lái)自人的 AAV載體血清型有 12種［19］，包括AAV1-AAV9、avianAAV、bovineAAV 和 canineAAV等，不同血清型AAV載體對(duì)不同細(xì)胞或組織的轉(zhuǎn)染效率不同。其中，AAV2和AAV5載體最常用于治療眼部疾病，AAV2載體具有親神經(jīng)性、優(yōu)先轉(zhuǎn)染神經(jīng)元、能有效轉(zhuǎn)染RGC［20］、表達(dá)持久等優(yōu)點(diǎn)。而 AAV5載體主要轉(zhuǎn)染光感受器和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞。其中rAAV2的雜合載體 rAAV2/2和rAAV2/6轉(zhuǎn)染RGC的效率最高［21］。但 AAV載體也存在不足，如攜帶基因小于5 kb、滴度低和表達(dá)“滯后性”，即被轉(zhuǎn)染細(xì)胞重組AAV-DNA轉(zhuǎn)變?yōu)檗D(zhuǎn)錄活躍的雙鏈模式需要一定時(shí)間。改良型ScAAV載體含有雙鏈基因組，具有更快啟動(dòng)轉(zhuǎn)基因表達(dá)和更高轉(zhuǎn)染效率等特點(diǎn)［22-23］，這或許會(huì)彌補(bǔ)AAV載體表達(dá)“滯后性”這一不足。

3 利用AAV載體基因治療TONI

3.1 AAV載體轉(zhuǎn)導(dǎo)營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)RGC的保護(hù)作用

目前用于治療視神經(jīng)損傷的營(yíng)養(yǎng)因子主要有睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(ciliary neurotrophic factor，CNTF)、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、血小板源性生長(zhǎng)因子 CC(platelet-derived growth factor CC，PDGF-CC)等。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，玻璃體注射BDNF和VEGF能增強(qiáng)RGC存活，而對(duì)軸突再生無(wú)明顯促進(jìn)作用［24-25］。D’Onofrio等［25］向成年大鼠玻璃體內(nèi)注射 AAV-VEGF-ZFP(鋅指蛋白)，可使RGC的存活數(shù)量提高2倍，ZFP的作用在于上調(diào) VEGF-A，進(jìn)一步促進(jìn) RGC存活。相似地，PDGF-CC也主要體現(xiàn)在增強(qiáng)RGC存活方面［26］，PDGF-CC通過(guò)調(diào)節(jié)糖原合成酶激酶-3β的磷酸化和表達(dá)對(duì)RGC起保護(hù)作用，同時(shí)也調(diào)節(jié)一些凋亡相關(guān)和神經(jīng)保護(hù)基因的表達(dá)。Hellstr?m等［27］將環(huán)腺苷酸類(lèi)似物(CTP-cAMP)聯(lián)合 rAAV2-CNTF-GFP注射到成年大鼠玻璃體內(nèi)，證實(shí)CNTF可以增強(qiáng)RGC存活和促進(jìn)軸突再生，但在此基礎(chǔ)上，CTP-cAMP并沒(méi)有進(jìn)一步的促進(jìn)作用。但后來(lái) Hellstr?m等［28］行鼠玻璃體內(nèi)注射 CTP-cAMP和 rAAV2-CNTF-GFP、rCNTF治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)約1/3RGC存活，其中27%的RGC軸突再生。這是一種基因聯(lián)合藥物治療方法，實(shí)驗(yàn)注藥時(shí)間幾乎與視神經(jīng)破壞手術(shù)同時(shí)進(jìn)行，并提出rCNTF對(duì)于急性視神經(jīng)損傷有潛在的治療意義。以上實(shí)驗(yàn)證明，CNTF能增強(qiáng)RGC存活和促進(jìn)軸突再生，正常情況下，CNTF主要存在于星型膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)，神經(jīng)受損后，CNTF在Müller細(xì)胞也有表達(dá)。

3.2 敲除 SOCS3、PTEN和 ephrinB3基因?qū)σ暽窠?jīng)修復(fù)的促進(jìn)作用 機(jī)體組織破壞后，通常進(jìn)入積極的修復(fù)狀態(tài)，但是以往一直認(rèn)為視神經(jīng)損傷后不可修復(fù)，損傷的神經(jīng)元內(nèi)是否存在抑制修復(fù)的基因?Smith等［29］把 AAV-cre(重組酶)注射到成年小鼠玻璃體內(nèi)，即利用AAV載體表達(dá)cre以敲除SOCS3基因，與沒(méi)有敲除 SOCS3組相比，AAV-cre組 RGC表現(xiàn)出顯著的再生能力，再向AAV-cre組玻璃體內(nèi)注入CNTF，能進(jìn)一步加強(qiáng) RGC軸突再生。后來(lái)，Hellstr?m 等［27］從正面證實(shí) SOCS3對(duì)視神經(jīng)修復(fù)的抑制作用，他們把rAAV2-SOCS3-GFP注射到成年大鼠玻璃體內(nèi)，使 RGC過(guò)度表達(dá) SOCS3，結(jié)果導(dǎo)致RGC軸突幾乎完全不能再生，同時(shí)也提出AAV2轉(zhuǎn)導(dǎo)CNTF表達(dá)比玻璃體內(nèi)直接注射rCNTF治療更有效。

視神經(jīng)損傷的修復(fù)不完全等同于RGC軸突的再生，還包括再生軸突能否進(jìn)入大腦，經(jīng)過(guò)視交叉，到達(dá)相應(yīng)靶區(qū)，并恢復(fù)視功能。2010年 Kurimoto等［30］提出敲除鼠 RGC內(nèi) PETN基因有利于細(xì)胞軸突再生，時(shí)隔2 a，他們?cè)俅芜M(jìn)行了相似的實(shí)驗(yàn)［31］，他們向成年小鼠眼內(nèi)注射AAV2-cre，以敲除PETN，2周后建立視神經(jīng)橫切外傷模型，同時(shí)眼內(nèi)注射酵母多糖(Zymosan)及 CPT-cAMP，以霍亂毒素 B(CTB)示蹤再生軸突，實(shí)驗(yàn)反復(fù)向玻璃體內(nèi)注射Zymosan及CPT-cAMP，10周后發(fā)現(xiàn)36%RGC存活，12周后大量視神經(jīng)全長(zhǎng)呈CTB陽(yáng)性，即視神經(jīng)全長(zhǎng)再生，大部分再生軸突到達(dá)視交叉上核，而僅注射AAV2-GFP、Zymosan及 CPT-cAMP組10周 RGC存活率為16%，視神經(jīng)CTB陽(yáng)性很少。該實(shí)驗(yàn)證明了視神經(jīng)損傷后視覺(jué)中央回路重建及部分視力恢復(fù)的可行性，實(shí)驗(yàn)中Zymosan主要作用是造成輕微持續(xù)的眼內(nèi)炎癥反應(yīng)，并促使一些炎性細(xì)胞如巨噬細(xì)胞分泌生長(zhǎng)因子和癌調(diào)蛋白，CPT-cAMP與酵母多糖共同促進(jìn)癌調(diào)蛋白與RGC捆綁以提高細(xì)胞再生［30］，這種輕微足量的連續(xù)炎癥刺激可以使軸突細(xì)胞再生并到達(dá)視神經(jīng)的全長(zhǎng)。對(duì)于這一類(lèi)似問(wèn)題，目前尚有爭(zhēng)議，有研究者［32］認(rèn)為癌調(diào)蛋白水平在玻璃體內(nèi)注射Zymosan后并沒(méi)有明顯增加，并推斷巨噬細(xì)胞源性癌調(diào)蛋白不可能是介導(dǎo)由眼內(nèi)炎癥引起這種有益作用的主要因素，而一定是另一機(jī)制所啟動(dòng)，同時(shí)也提出，癌調(diào)蛋白的作用與細(xì)胞內(nèi)cAMP水平上升密切相關(guān)。cAMP是調(diào)節(jié)神經(jīng)元存活和神經(jīng)軸突再生至關(guān)重要的第二信使，輔助促進(jìn)軸突再生，CPT-cAMP的濃度也是實(shí)驗(yàn)成功的要素之一。此外，Duffy等［33］發(fā)現(xiàn)，敲除小鼠 ephrinB3基因，可在視神經(jīng)損傷點(diǎn)外1000 μm發(fā)現(xiàn)再生軸突，明顯促進(jìn)軸突再生，并認(rèn)為ephrinB3是軸突生長(zhǎng)重要的鞘磷脂相關(guān)的生理抑制因子。

4 總結(jié)

本文綜述了神經(jīng)損傷后周?chē)h(huán)境的改變以及利用AAV載體基因治療TONI的相關(guān)進(jìn)展，表明視神經(jīng)損傷后微環(huán)境變化的復(fù)雜性，顯示AAV載體在視神經(jīng)損傷基因治療中強(qiáng)大的應(yīng)用潛能，同時(shí)也啟示我們視神經(jīng)損傷基因治療會(huì)是一種更有效的治療方法。目前AAV載體攜帶基因容量小等問(wèn)題尚未得到有效解決，而且基因治療過(guò)程復(fù)雜，涉及從胞外到胞核及轉(zhuǎn)染表達(dá)等一系列步驟，其間可能發(fā)生AAV顆粒降解，或因缺乏對(duì)靶細(xì)胞的專一性而轉(zhuǎn)染其他組織，或不能在特定組織大量有效的轉(zhuǎn)染等，都是有待解決的問(wèn)題。另外，目前多數(shù)實(shí)驗(yàn)采用成年鼠視神經(jīng)外傷為模型，然而有研究表明:鼠RGC固有生存能力受其年齡影響［34］，外傷后RGC死亡和再生能力受到 RGC發(fā)育形成時(shí)間先后的影響［35］，最后，在正常視網(wǎng)膜和病變視網(wǎng)膜中，AAV載體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染能力也是不同的［36］?？傊绊懟蛑委煰熜У囊蛩剡h(yuǎn)不止這些，相信隨著分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展，神經(jīng)細(xì)胞死亡、軸突再生機(jī)制的進(jìn)一步闡明，會(huì)有更佳的改良型AAV載體應(yīng)用于臨床。

1 Acland GM，Aguirre GD，Ray J，Zhang Q，Aleman TS，Cideciyan AV，et al.Gene therapy restores vision in a canine model of childhood bl indnes［J］.Nat Genet，2001，28(1):92-95.

2 Stieger K，Schroeder J，Provost N，Mendes-Madeira A，Belbellaa B，Le Meur G，et al.Detection of intact rAAV particles up to 6 years after successful gene transfer in the retina of dogs and primates［J］.Mol T-her，2009，17(3):516-523.

3 Kanamori A，Catrinescu MM，Kanamori N，Mears KA，Beaubien R，Levin LA.Superoxide is an associated signal for apoptosis in axonal injury［J］.Brain，2010，133(9):2612-2625.

4 Catrinescu MM，Chan W，Mahammed A，Gross Z，Levin LA.Superoxide signaling and cell death in retinal ganglion cell axotomy:Effects of metallocorroles［J］.Exp Eye Res，2012，97(1):31-35.

5 Koeberle PD，Wang Y，Schlichter LC.Kv1.1 and Kv1.3 channels contribute to the degeneration of retinal ganglion cells after optic nerve transection in vivo［J］.Cell Death Differ，2010，17(1):134-144.

6 Monnier PP，D’Onofrio PM，Magharious M，Hollander AC，Tassew N，Szydlowska K，et al.Involvement of caspase-6 and caspase-8 in neuronal apoptosis and the regenerative failure of injured retinal ganglion cells［J］.J Neurosci，2011，31(29):10494-10505.

7 Ahmed Z，Kalinski H，Berry M，Almasieh M，Ashush H，Slager N，et al.Ocular neuroprotection by siRNA targeting caspase-2［J］.Cell Death Dis，2011，16(2):e173.

8 Fernandes KA，Harder JM，F(xiàn)ornarola LB，F(xiàn)reeman RS，Clark AF，Pang IH，et al.JNK2 and JNK3 are major regulators of axonal injury-induced retinal ganglion cell death［J］.Neurobiol Dis，2012，46(2):393-401.

9 Winzeler AM，Mandemakers WJ，Sun MZ，Stafford M，Phillips CT，Barres BA.The lipid sulfatide is a novel myelin-associated inhibitor of CNS axon outgrowth［J］.J Neurosci，2011，31(17):6481-6492.

10 Rodríguez-Muela N，Boya P.Axonal damage，autophagy and neuronal survival［J］.Autophagy，2012，8(2):286-288.

11 Thanos S，B?hm MR，Schallenberg M，Oellers P.Traumatology of the optic nerve and contribution of crystallins to axonal regeneration［J］.Cell Tissue Res，2012，349(1):49-69.

12 Leibinger M，Müller A，Andreadaki A，Hauk TG，Kirsch M，F(xiàn)ischer D.Neuroprotective and axon growth-promoting effects following inflammatory stimulation on mature retinal ganglion cells in mice depend on ciliary neurotrophic factor and leukemia inhibitory factor［J］.J Neurosci，2009，29(45):14334-14341.

13 Magharious M，D’Onofrio PM，Hollander A，Zhu P，Chen J，Koeberle PD.Quantitative iTRAQ analysis of retinal ganglion cell degeneration after optic nerve crush［J］.J Proteome Res，2011，10(8):3344-3362.

14 Lukas TJ，Wang AL，Yuan M，Neufeld AH.Early cellular signaling responses to axonal injury［J］.Cell Commun Signal，2009，13:5.

15 Nadal-Nicolás FM，Jiménez-López M，Sobrado-Calvo P，Nieto-López L，Cánovas-Martínez I，Salinas-Navarro M，et al.Brn3a as a marker of retinal ganglion cells:Qualitative and quantitative time course studies in naive and optic nerve injured retinas［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2009，50(8):3860-3868.

16 Levkovitch-Verbin H，Dardik R，Vander S，Melamed S.Mechanism of retinal ganglion cells death in secondary degeneration of the optic nerve［J］.Exp Eye Res，2010，91(2):127-134.

17 Vander S，Levkovitch-Verbin H.Regulation of cell death and survival pathways in secondary degeneration of the optic nerve-a long-term study［J］.Curr Eye Res，2012，37(8):740-748.

18 Goncalves MA.Adeno-associated virus:from defective virus to effective vector［J］.Virol J，2005，6(2):43-59.

19 Daya S，Berns KI.Gene therapy using adeno-associated virus vectors［J］.Clin Microbiol Rev，2008，21(4):583-593.

20 Kolstad KD，Dalkara D，Guerin K，Visel M，Hoffmann N，Schaffer DV，et al.Changes in adeno-associated virus-mediated gene delivery in retinal degeneration.changes in adeno-associated virus-mediated gene delivery in retinal degeneration［J］.Hum Gene Ther，2010，21(5):571-578.

21 Hellstr?m M，Ruitenberg MJ，Pollett MA，Ehlert EM，Twisk J，Verhaagen J，et al.Cellular tropism and transduction properties of seven adeno-associated viral vector serotypes in adult retina after intravitreal injection［J］.Gene Ther，2009，16(4):521-532.

22 Natkunarajah M，Trittibach P，McIntosh J，Duran Y，Barker SE，Smith AJ，et al.Assessment of ocular transduction using single-stranded and self-complementary recombinant adeno-associated virus serotype 2/8［J］.Gene Ther，2008，15(6):463-467.

23 Kong F，Li W，Li X，Zheng Q，Dai X，Zhou X，et al.Self-complementary AAV5 vector facilitates quicker transgene expression in photoreceptor and retinal pigment epithelial cells of normal mouse［J］.Exp Eye Res，2010，90(5):546-554.

24 Hellstr?m M，Harvey AR.Retinal ganglion cell gene therapy and visual system repair［J］.Curr Gene Ther，2011，11(2):116-131.

25 D’Onofrio PM，Thayapararajah M，Lysko MD，Magharious M，Spratt SK，Lee G，et al.Gene therapy for traumatic central nervous system injury and stroke using an engineered zinc finger protein that upregulatesVEGF-A［J］.J Neurotrauma，2011，28(9):1863-1879.

26 Tang Z，Arjunan P，Lee C，Li Y，Kumar A，Hou X，et al.Survival effect of PDGF-CC rescues neurons from apoptosis in both brain and retina by regulating GSK3beta phosphorylation［J］.J Exp Med，2010，207(4):867-880.

27 Hellstr?m M，Muhling J，Ehlert EM，Verhaagen J，Pollett MA，Hu Y，et al.Negative impact of rAAV2 mediated expression of SOCS3 on the regeneration of adult retinal ganglion cell axons［J］.Mol Cell Neurosci，2011，46(2):507-515.

28 Hellstr?m M，Pollett MA，Harvey AR.Post-injury delivery of rAAV2-CNTF combined with short-term pharmacotherapy is neuroprotective and promotes extensive axonal regeneration after optic nerve trauma［J］.J Neurotrauma，2011，28(12):2475-2483.

29 Smith PD，Sun F，Park KK，Cai B，Wang C，Kuwako K，et al.SOCS3 deletion promotes optic nerve regeneration in vivo［J］.Neuron，2009，64(5):617-623.

30 Kurimoto T，Yin Y，Omura K，Gilbert HY，Kim D，Cen LP，et al.Longdistance axon regeneration in the mature optic nerve:contributions of oncomodulin，cAMP，and pten gene deletion［J］.J Neurosci，2010，30(46):15654-15663.

31 de Lima S，Koriyama Y，Kurimoto T，Oliveira JT，Yin Y，Li Y，et al.Full-length axon regeneration in the adult mouse optic nerve and partial recovery of simple visual behaviors［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2012，109(23):9149-9154.

32 Hauk TG，Müller A，Lee J，Schwendener R，F(xiàn)ischer D.Neuroprotective and axon growth promoting effects of intraocular inflammation do not depend on oncomodulin or the presence of large numbers of activated macrophages［J］.Exp Neurol，2008，209(2):469-482.

33 Duffy P，Wang X，Siegel CS，Tu N，Henkemeyer M，Cafferty WB，et al.Myelin-derived ephrinB3 restricts axonal regeneration and recovery after adult CNS injury［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2012，109(13):5063-5068.

34 Luo JM，Geng YQ，Zhi Y，Zhang MZ，van Rooijen N，Cui Q.Increased intrinsic neuronal vulnerability and decreased beneficial reaction of macrophages on axonal regeneration in aged rats［J］.Neurobiol Aging，2010，31(6):1003-1009.

35 Dallimore EJ，Park KK，Pollett MA，Taylor JS，Harvey AR.The life，death and regenerative ability of immature and mature rat retinal ganglion cells are influenced by their birthdate［J］.Exp Neurol，2010，225(2):353-365.

36 Kolstad KD，Dalkara D，Guerin K，Visel M，Hoffmann N，Schaffer DV，et al.Changes in adeno-associated virus-mediated gene delivery in retinal degeneration［J］.Hum Gene Ther，2010，21(5):571-578.