一株豬源屎腸球菌的分離及其種屬鑒定

張利勃，張 瑞，王小杰，謝雙語，高慎陽

（遼寧醫(yī)學院畜牧獸醫(yī)學院畜產(chǎn)品質(zhì)量與工程重點實驗室，遼寧 錦州 121001）

一株豬源屎腸球菌的分離及其種屬鑒定

張利勃，張 瑞，王小杰，謝雙語，高慎陽?

（遼寧醫(yī)學院畜牧獸醫(yī)學院畜產(chǎn)品質(zhì)量與工程重點實驗室，遼寧 錦州 121001）

為分離出可用作豬用微生態(tài)制劑的腸道益生菌株，本研究選擇錦州市凌海大業(yè)鄉(xiāng)生態(tài)豬場為試驗采樣點，采集10日齡左右健康仔豬腸道糞樣12份。利用MRS瓊脂培養(yǎng)基分離培養(yǎng)初篩目標分離菌株的形態(tài)特征和培養(yǎng)特性，再通過生理生化鑒定法和16SrRNA基因分子鑒定法，最終確定1株分離菌為屎腸球菌，并命名為LN/ EF1312株，為后續(xù)腸道益生球菌的益生功能研究奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。

仔豬；屎腸球菌；16SrRNA；益生菌

腸球菌是動物和人體消化道內(nèi)正常存在的一類微生物，由于其在腸黏膜具有較強的耐受和定植能力，保證了其益生性能的發(fā)揮，尤其近年來益生菌制劑作為飼用抗生素替代產(chǎn)品之一越來越受到人們的重視，加之兼性厭氧的生理特性，使其與厭氧培養(yǎng)保存條件苛刻的雙歧桿菌相比，更適合于生產(chǎn)和應(yīng)用[1]。早在2008年，我國農(nóng)業(yè)部第1126號就公告公布了允許使用的飼料添加劑品種目錄，其中微生物飼料添加劑有16種，屎腸球菌（Enterococcus faecium）糞腸球菌（Enterococcusfaecalis）和乳酸腸球菌（Lactococcus lactis）都包括在內(nèi)。研究表明，優(yōu)良的益生菌菌株主要來自動物體內(nèi)，能夠耐受胃腸道內(nèi)環(huán)境生長快能產(chǎn)乳酸抑制病原菌生長及能夠在腸道內(nèi)定植[2-3]。本試驗從10日齡健康仔豬新鮮糞便中分離出1株腸球菌，經(jīng)種屬特異性鑒定為一株屎腸球菌，這為開發(fā)飼用益生菌產(chǎn)品提供了參考菌株來源。

1 材料與方法

1.1 材料試驗樣品采自于錦州市凌海大業(yè)鄉(xiāng)生態(tài)豬場仔豬新鮮糞便12份。質(zhì)控屎腸球菌ATCC35667購自南京便診生物科技有限公司；MRS培養(yǎng)基購自青島海博生物技術(shù)有限公司；腸球菌菌屬生化鑒定管購自杭州天和微生物試劑有限公司；革蘭氏陽性菌基因組提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒、2×Taq PCR Master Mix、DNA Marker等均購自北京康為世紀生物科技有限公司。引物合成與基因測序委托上海生物工程有限公司完成。

1.2 細菌的分離與純化在無菌操作臺內(nèi)，取糞便樣品各1 g，用無菌的生理鹽水10倍連續(xù)稀釋至10-5，分別取10-3、10-4、10-5三個稀釋度的懸液50μL涂布于MRS選擇平板培養(yǎng)基上，做好標記。37℃兼性厭氧條件下連續(xù)培養(yǎng)36～48 h，挑取疑似單菌落，反復(fù)劃線分離至獲得純菌株，并進行革蘭氏染色鏡檢觀察菌體形態(tài)和純度。經(jīng)純化無雜菌者保存4℃冰箱備用。

1.3 菌落形態(tài)與染色特征觀察將分離純化的菌株涂布于MRS固體培養(yǎng)基平板上，以不同溫度范圍內(nèi)以兼性厭氧條件下分別培養(yǎng)24～48 h后，進行菌落形態(tài)觀察，并挑取菌落涂片鏡檢。將初步鑒定為腸球菌的菌落接種于MRS肉湯中純培養(yǎng)，以便下一步生化試驗鑒定[4-5]。

1.4 分離菌株生化鑒定依據(jù)伯杰系統(tǒng)細菌學手冊的標準及腸球菌屬生化鑒定管的說明進行分離菌的一系列生化試驗鑒定。

1.5 分離菌株屬種特異性分子鑒定

1.5.1 細菌模板DNA的制備 參照革蘭氏陽性菌基因組DNA提取試劑盒說明書進行，提取產(chǎn)物作為模板DNA，并采用分光光度計和電泳法計算DNA的含量及純度。檢驗合格保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 種屬特異性分析 在參考王亞賓等設(shè)計的腸球菌16S rRNA基因擴增屬特異性引物（見表1中E1、E2）和Char lene R等設(shè)計的腸球菌種特異性引物（見表1中FM1、FM2）基礎(chǔ)之上[5-6]，進行多重PCR擴增分析。PCR反應(yīng)體系為30μL，其中含2× Taq MasterMix15μL，模板DNA 1μL，ddH2O 8μL，3對引物上下游引物各1μL。擴增程序如下：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，49℃退火復(fù)性30 s，72℃延伸30 s，進行30個循環(huán)后72℃終延伸10 min。取10μL擴增產(chǎn)物進行電泳，瓊脂糖凝膠為1%，用凝膠成像系統(tǒng)記錄結(jié)果。

表1 腸球菌種屬特異性引物列表Table1 Enterococcus species-specific primers list

1.5.3 16S rRNA基因測序分析 將上述屬特異性PCR擴增產(chǎn)物膠回收后經(jīng)上海生工測序，并利用在線Blast分析分離菌株16S rRNA基因歸屬。

2 結(jié)果

2.1 菌落形態(tài)特征及染色特性經(jīng)篩選，分離出一株疑似腸球菌菌株。該菌株在MRS固體平板培養(yǎng)基上菌落特征一致：灰白色、圓形、邊緣整齊、表面光滑而有粘性；革蘭氏染色為G+，菌體形態(tài)為球形，成對或短鏈狀排列，見圖1。

圖1分離菌株純化后革蘭染色鏡檢結(jié)果Fig.1 Gram staining results of purified isolates

2.2 生理生化特性生化試驗表明，該菌為兼性厭氧菌，在10～45℃條件下均能生長，發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸但不產(chǎn)氣，產(chǎn)生亮氨酸氨基肽酶（LAP酶），能水解亮氨酸-?-萘酰胺；能在含有6.5%NaCl肉湯中生長，并能水解七葉苷，過氧化氫酶試驗及氧化酶試驗均為陰性，以上這些生化反應(yīng)與常見細菌鑒定手冊中腸球菌屬的描述完全相符。

2.3 分子鑒定結(jié)果擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳可見16S rRNA基因在約1 096 bp和215 bp處均有一條特異性亮帶，與預(yù)期片段大小相符（見圖2），該結(jié)果與基因測序結(jié)果相符；而糞腸球菌特異性引物未擴增出360 bp條帶。

圖2 PCR鑒定結(jié)果Fig.2 PCR identification results

3 討論

腸球菌在自然界分布廣泛，人、動物腸道，食品、物料及少數(shù)臨床樣品中均有存在，本試驗對10日齡仔豬新鮮糞便進行了腸球菌的分離，經(jīng)生理生化和16S rRNA基因分子鑒定，結(jié)果顯示，分離到一株屎腸球菌、命名為LN/EF1312株。由于屎腸球菌表型差異較大，易與屎腸球菌群其他細菌發(fā)生混淆，這給生化鑒定方法增加了困難，本次測定的豬的屎腸球菌符合率大于50%僅有3株，而進一步經(jīng)多重種屬特異性PCR鑒定后僅有1株符合率達90%為確切的屎腸球菌，所以采用16S rRNA基因序列這個分子鐘（molecular clock）來評估細菌間的相關(guān)性和鑒定未知細菌屬和種水平是非常必要的[8]。由于本試驗將傳統(tǒng)微生物分離篩選與細菌種屬決定基因分子鑒定的方法相結(jié)合，使得目標益生菌株篩選效率顯著提高，試驗中所積累的經(jīng)驗方法與試驗數(shù)據(jù)可為后續(xù)大量準確篩選腸豬道益生菌株工作奠定堅實基礎(chǔ)。同時，本實驗室將對本試驗中所分離屎腸菌LN/EF1312株進行后續(xù)研究，即該菌株在消化道內(nèi)是否能夠發(fā)揮益生作用，如影響動物的營養(yǎng)代謝、產(chǎn)生非特異性免疫調(diào)節(jié)因子、產(chǎn)生干擾素或作為免疫復(fù)活劑刺激胃腸非特異性局部免疫等。

4 結(jié)論

本研究成功地從仔豬腸道內(nèi)分離到一株屎腸球菌，經(jīng)種屬特異性鑒定后命名為屎腸菌LN/EF1312株，為豬用微生態(tài)制劑的研制提供了參考菌源。

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[2]周霞，王曉蘭，剡根強，等.腸球菌研究進展[J].石河子大學學報（自然科學），2008，06：708-712.

[3]王亞俊.基于基因組的屎腸球菌進化和功能研究[D].上海交通大學，2012，1：125.

[4]李梅，李衛(wèi)芬，姚江濤.豬源腸球菌的分離及鑒定[J].上海畜牧獸醫(yī)通訊，2007，（3）：50-51.

[5]路娟，劉文博，姜英，等.糞腸球菌和屎腸球菌的耐藥特征[J].中華醫(yī)院感染學雜志，2006，10：1169-1171.

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（編輯：張婷婷）

Isolation and species identification ofan enterococcus faecium from piglets feces

Zhang Libo,Zhang Rui,Wang Xiaoj ie,Xie Shuangyu,Gao Shenyang*
（Key Laboratory of Animal Products Quality and Engineering,Col lege of Animal Husbandry and Veterinary Medicine,Liaoning Medical University,Liaoning Jinzhou 121001）

In order to isolate the intestinal live strains which can be used to develop probiotics additive for pig,a ecological pig farm in Daye township of Linghai in Jinzhou city were selected for gathering intestinal fecal samples of heal thy piglets with about 10-day age.The total 12 samples were isolated cul tured using MRS agar medium at the beginning,then isolated st rain clones with the classic cul ture features and morphological characteristics,were subsequent ly identi f ied through the physiological and biochemical assay method combining with 16S rRNA gene molecular identi fication method,final ly a confirmed isolated strain of enterococcus faecium was named LN/EF1312 strain.This resul t provide foundation for the research on the function of l ive intestinal enterococcus.

Piglets;Excrement enterococcus;16S rRNA;Probiotics

S852.6

：B

：1672-9692(2014)02-0041-03

2013-12-11

作者簡歷：張利勃（1974-），男，碩士研究生，副教授，主要從事微生物與免疫學研究工作。

高慎陽（1979-），男，博士在讀，副教授，研究生導(dǎo)師，研究方向為微生物與免疫學。

遼寧醫(yī)學院校企合作橫向課題（LY20110301），遼寧省農(nóng)業(yè)科技攻關(guān)重點項目（2011214001），國家自然基金（青年項目，31101798）