響應(yīng)面法優(yōu)化胃蛋白酶制備花椒籽蛋白抗菌肽的研究

姜太玲，吳紅洋，王 微，張志清

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川雅安 625014）

響應(yīng)面法優(yōu)化胃蛋白酶制備花椒籽蛋白抗菌肽的研究

姜太玲，吳紅洋，王 微，張志清*

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川雅安 625014）

以花椒籽蛋白為原料，采用胃蛋白酶水解制備抗菌肽。在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，應(yīng)用Box-Behnken中心組合 方 法 進(jìn) 行 四 因 素 三 水 平 的 實(shí) 驗(yàn) 設(shè) 計(jì) ，以 大 腸 桿 菌（Escherichia coli）抑 菌 率 為 響 應(yīng) 值 建 立 數(shù) 學(xué) 模 型 ，確 定 底 物 濃 度4.9%、酶與底物比（g/g）0.9∶100、pH2.0、酶解溫度32℃、酶解時(shí)間3h為最佳酶解條件。此條件下酶解產(chǎn)生的抗菌肽復(fù)合物的抑菌率可以達(dá)到60.96%。

花椒籽蛋白，胃蛋白酶，抗菌肽，響應(yīng)面分析法

花椒籽，學(xué)名椒目，是花椒果皮生產(chǎn)中的主要副產(chǎn)物，其蛋白質(zhì)含量豐富，脫脂后的花椒籽種仁中蛋白質(zhì)含量可以高達(dá)60.34%[1]。從氨基酸組成上看，花椒籽中有17種氨基酸，總量為9.43%，其中必需氨基酸（EAA）占4.03%，種仁粗蛋白中的EAA有谷氨酸、精氨酸、天冬氨酸、賴(lài)氨酸及組氨酸[1-2]。經(jīng)評(píng)定，花椒籽蛋白質(zhì)中的氨基酸得分為58，是一種優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)[3]。

抗菌肽（Antibacterial peptide），被認(rèn)為是最有可能替代抗生素用于治療疾病的新型抗菌藥物，具有物質(zhì)分子量小、活性穩(wěn)定、水溶性好，還具有抗菌力強(qiáng)、抗菌譜廣、無(wú)污染、不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)[4-5]。目前對(duì)于抗菌肽的研究主要以動(dòng)物為主，對(duì)植物蛋白來(lái)源的抗菌肽研究還相對(duì)較少。有學(xué)者用化學(xué)法從中果咖啡、黑種草水稻、稗草、蘿卜等植物種子中分離得到了具有抗菌活性的多肽[6-9]；周世成、龔吉軍、Xiao等[10-12]分別用蛋白酶從小麥蛋白和油茶粕蛋白、麻瘋樹(shù)粕蛋白中分離得到具有抗菌活性的抗菌肽，這些發(fā)現(xiàn)為學(xué)者們從植物蛋白中獲取抗菌肽提供了重要的依據(jù)。花椒籽蛋白中含有較多的氨基酸，這給從花椒籽蛋白中分離出具有抗菌活性的多肽提供了可能，這對(duì)提高花椒籽的深加工水平，開(kāi)發(fā)出高附加值的產(chǎn)品，對(duì)促進(jìn)經(jīng)濟(jì)發(fā)展具有重要的作用。

本研究以花椒籽蛋白抗菌肽復(fù)合物為研究對(duì)象，選取大腸桿菌為實(shí)驗(yàn)菌株，旨在通過(guò)采用單因素實(shí)驗(yàn)、響應(yīng)面回歸分析對(duì)酶解條件進(jìn)行優(yōu)化，以得到產(chǎn)生抗菌肽的最佳酶解條件，也為分離純化其中的抗菌肽組分提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

花椒籽蛋白 經(jīng)堿處理制得（含量為259.70mg/g）；大腸桿菌（ATCC 25922） 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供；氫氧化鈉、瓊脂粉、氯化鈉 成都科龍化工試劑廠；蛋白胨、牛肉膏 北京奧博星生物科技有限責(zé)任公司；胃蛋白酶1∶3000（活力1∶3000～1∶3500） 如吉生物科技有限公司；胰蛋白酶1∶250（活力≥250N.F.U/mg）、中性蛋白酶（活力＞60000U/g）、酸性蛋白酶（活力≥50U/mg） 北京華邁科生物技術(shù)有限責(zé)任公司；堿性蛋白酶（活力≥50U/mg） 上海源葉生物科技有限公司；LB液體培養(yǎng)基 蛋白胨10g、牛肉膏3g、氯化鈉5g，蒸餾水1000mL，調(diào)pH至7.4，121℃高壓蒸汽滅菌15min。

CP225D型電子天平 德國(guó)賽多利斯股份公司；SYQ-DSX-280B型手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ型潔凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；HZQ-A型恒溫振蕩培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；真空冷凍干燥機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；Thermo ST16R冷凍離心機(jī) 美國(guó)賽默飛有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 花椒籽蛋白抗菌肽的制備工藝 制備工藝參考薛培宇等的方法，并作一定的修改[13]。稱(chēng)取適量花椒籽蛋白溶于一定量的去離子水中，在恒溫水浴鍋中預(yù)熱，達(dá)到反應(yīng)溫度后調(diào)節(jié)溶液的pH，然后加入一定量的蛋白酶進(jìn)行反應(yīng)，在反應(yīng)過(guò)程中不斷滴加HCl或NaOH以維持溶液的pH。反應(yīng)結(jié)束后，取出放入90℃水浴滅酶15min，冷卻，然后4℃、8000r/min離心10min，取上清液，真空冷凍干燥，凍干粉保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 抑菌活性的測(cè)定 稱(chēng)取0.250g凍干粉溶于2mL去離子水中，調(diào)節(jié)樣液的pH至近中性，4℃、12000r/min離心5min，然后用0.22μm的濾膜過(guò)濾除菌后進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。

抑菌率的測(cè)定參考文獻(xiàn)[14]。以大腸桿菌為受試菌，接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)24h。取過(guò)濾除菌后的樣液100μL，加LB培養(yǎng)基30μL和菌懸液70μL（菌懸液濃度為103～104CFU/mL）并混勻，37℃、150r/min搖床孵育1h，取100μL傾注于LB平板，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，計(jì)算菌落數(shù)。以去離子水為對(duì)照組。計(jì)算抑菌率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

抑菌率（%）=（對(duì)照組菌落數(shù)-實(shí)驗(yàn)組菌落數(shù)）/對(duì)照組菌落數(shù)×100

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 本研究以花椒籽蛋白對(duì)大腸桿菌的抑菌率為對(duì)照，考察胃蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、酸性蛋白酶這5種酶分別在底物濃度2.5%、酶與底物比1∶100、酶解3h時(shí)提取出的酶解產(chǎn)物對(duì)大腸桿菌抑菌率大小，從中優(yōu)選最佳酶進(jìn)行后續(xù)的條件優(yōu)化，其廠家提供的較優(yōu)參考酶解條件如表1所示。

表1 不同蛋白酶的水解條件Table 1 Hydrolysis conditions of 5 proteases

對(duì)所選酶的酶解條件，主要考察底物濃度、酶與底物比、pH、酶解溫度及酶解時(shí)間對(duì)花椒籽蛋白酶解液抑菌效果的影響。

1.2.3.1 底物濃度對(duì)抑菌活性的影響 底物濃度分別為1%、2%、3%、4%、5%，在酶與底物比1∶100、pH 2.0、酶解溫度37℃時(shí)，酶解3h時(shí)后的產(chǎn)物按照1.2.2的方法測(cè)定抑菌活性。

1.2.3.2 酶與底物比對(duì)抑菌活性的影響 酶與底物比分別為1∶200、1∶100、3∶200、2∶100、5∶200，在底物濃度4%、pH2.0、酶解溫度37℃時(shí)，酶解3h時(shí)后的產(chǎn)物按照1.2.2的方法測(cè)定抑菌活性。

1.2.3.3 pH對(duì)抑菌活性的影響 pH分別為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0，在底物濃度4%、酶與底物比1∶100、酶解溫度37℃時(shí)，酶解3h時(shí)后的產(chǎn)物按照1.2.2的方法測(cè)定抑菌活性。

1.2.3.4 酶解溫度對(duì)抑菌活性的影響 酶解溫度分別為27、32、37、42、47℃，在底物濃度4%、酶與底物比1∶100、pH1.5時(shí)，酶解3h時(shí)后的產(chǎn)物按照1.2.2的方法測(cè)定抑菌活性。

1.2.3.5 酶解時(shí)間對(duì)抑菌活性的影響 酶解時(shí)間分別為2、3、4、5h，在底物濃度4%、酶與底物比1∶100、pH1.5、酶解溫度37℃時(shí)，產(chǎn)物按照1.2.2的方法測(cè)定抑菌活性。

1.2.4 響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在酶解時(shí)間為3h的條件下，對(duì)底物濃度、酶與底物比、酶解pH和酶解溫度4個(gè)影響酶解產(chǎn)物抑菌活性的主要因素進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。應(yīng)用Box-Behnken中心組合進(jìn)行四因素三水平的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以抑菌率為響應(yīng)值，采用Desigh-Expert7.0.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)因素及水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面分析因素水平表Table 2 Analytical factors and levels for RSM

1.3 數(shù)據(jù)處理

響應(yīng)面分析以外的其他數(shù)據(jù)采用Excel進(jìn)行顯著性分析，p＜0.05為差異顯著，p＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶的篩選

花椒籽蛋白及5種蛋白酶酶解花椒籽蛋白所得的酶解液對(duì)大腸桿菌的抑菌活性見(jiàn)圖1。由圖1可知，花椒籽蛋白對(duì)大腸桿菌的抑菌活性較弱，而5種蛋白酶的酶解產(chǎn)物對(duì)大腸桿菌表現(xiàn)出的抑菌活性都較蛋白質(zhì)高。其中胃蛋白酶酶解產(chǎn)物的抑菌率最高，達(dá)到54.35%，不同的蛋白酶酶解時(shí)肽段位點(diǎn)具有一定的氨基酸序列特異性，胃蛋白酶傾向于剪切羧基端或氨基端為芳香族氨基酸或亮氨酸的肽鍵，從而暴露出了具有抑菌活性的小分子肽段。因此，本研究選取胃蛋白酶制備抗菌肽。

圖1 花椒籽蛋白及酶的種類(lèi)對(duì)抑菌活性的影響Fig.1 Effect of prickly ash seed protein enzyme type on antibacterial activity

2.2 胃蛋白酶酶解花椒籽蛋白制備抗菌肽主要影響因素分析

2.2.1 底物濃度對(duì)抑菌活性的影響 不同底物濃度對(duì)酶解液抑菌效果的影響結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，隨著底物濃度的增加，酶解液的抑菌效果也逐漸增加，在底物濃度為4%時(shí)酶解液的抑菌效果達(dá)到最大，隨著底物濃度的升高，抑菌效果出現(xiàn)下降的趨勢(shì)，底物濃度增大導(dǎo)致酶解不完全，其中的抑菌組分的對(duì)應(yīng)比例下降，導(dǎo)致抑菌效果降低。因此，最佳底物濃度為4%，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)底物濃度選擇范圍為3%～5%。

圖2 底物濃度對(duì)抑菌活性的影響Fig.2 Effect of substrate concentration on antibacterial activity

2.2.2 酶與底物比對(duì)抑菌活性的影響 不同酶與底物比對(duì)酶解液抑菌效果的影響結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，隨著酶添加量的增加，酶解產(chǎn)物的抑菌活性呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。在酶與底物比為1∶100時(shí)，酶解液的抑菌效果是最高的。當(dāng)酶濃度過(guò)高時(shí)，底物濃度相對(duì)較低，酶與底物沒(méi)有完全結(jié)合，當(dāng)酶用量足夠高時(shí)，過(guò)量的酶會(huì)加快多肽水解成更小的分子片段，導(dǎo)致抑菌活性降低。因此，最佳酶與底物比為1∶100，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)酶與底物比選擇范圍為1∶200～3∶200。

2.2.3 pH對(duì)抑菌活性的影響 不同pH對(duì)酶解液抑菌效果的影響結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，隨著pH的增大，花椒籽蛋白酶解液對(duì)大腸桿菌的抑制作用呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。pH在1.5時(shí)，酶解液的抑菌活性達(dá)到最大。pH低于或高于1.5都可能對(duì)胃蛋白酶的結(jié)構(gòu)造成影響，導(dǎo)致酶的活性降低，從而使酶解液的抑菌活性受到影響。因此，最佳pH為1.5，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)pH選擇范圍用1.0～2.0。

2.2.4 酶解溫度對(duì)抑菌活性的影響 不同溫度對(duì)酶解液抑菌效果的影響結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可知，隨著酶解溫度的升高，酶解液對(duì)大腸桿菌的抑制作用是先增大后減小的，在溫度為37℃時(shí)酶解液的抑菌效果達(dá)到最高。如果反應(yīng)溫度過(guò)低，會(huì)降低酶與底物的碰撞幾率；但溫度過(guò)高時(shí)，就會(huì)導(dǎo)致蛋白酶喪失或部分喪失催化活性，不利于酶解反應(yīng)進(jìn)行，導(dǎo)致酶解液的抑菌效果下降。因此，最佳酶解溫度為37℃，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)酶解溫度選擇范圍32～42℃。

圖3 酶與底物比對(duì)抑菌活性的影響Fig.3 Effect of enzyme/substrate ratio on antibacterial activity

圖4 pH對(duì)抑菌活性的影響Fig.4 Effect of pH on antibacterial activity

圖5 酶解溫度對(duì)抑菌活性的影響Fig.5 Effect of hydrolysis temperature on antibacterial activity

2.2.5 酶解時(shí)間對(duì)抑菌活性的影響 不同酶解時(shí)間對(duì)酶解液抑菌效果的影響結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖6可知，花椒籽蛋白酶解液對(duì)大腸桿菌的抑菌效果隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)，在酶解時(shí)間為3h時(shí)達(dá)到最大。酶解時(shí)間太短時(shí)，具有抑菌活性的殘基不能暴露出來(lái)，顯示不出抑菌活性，而反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)，則會(huì)導(dǎo)致肽的結(jié)構(gòu)受損，趨向于將肽段酶解為小分子的短肽，使抑菌活性會(huì)有所降低，但變化不大；同時(shí)隨酶解時(shí)間增加，底物產(chǎn)量增加也會(huì)抑制酶解反應(yīng)的進(jìn)行。因此，最佳酶解時(shí)間為3h，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中的酶解時(shí)間定為3h。

圖6 酶解時(shí)間對(duì)抑菌活性的影響Fig.6 Effect of hydrolysis time on antibacterial activity

通過(guò)上述單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，底物濃度、酶與底物比、pH、酶解溫度和酶解時(shí)間這5個(gè)因素對(duì)花椒籽蛋白抗菌肽的抑菌活性影響均顯著。單因素實(shí)驗(yàn)所確定的胃蛋白酶制備花椒籽蛋白抗菌肽的合適條件為：底物濃度4%，酶與底物比1∶100，pH1.5，酶解溫度37℃，酶解時(shí)間3h，此實(shí)驗(yàn)結(jié)果為設(shè)定響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平的零點(diǎn)提供參考。

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化胃蛋白酶酶解花椒籽蛋白制備抗菌肽

2.3.1 響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及制備的抗菌肽抑菌效果

響應(yīng)面分析方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果和方差分析見(jiàn)表3和表4。

由表4可以看出，回歸模型是顯著的（p＜0.0001）。模型的R2=98.72%，表明有98.72%的抑菌率變化可由該模型解釋。模型失擬項(xiàng)的p檢驗(yàn)值為0.7925（p＞0.05），這說(shuō)明使用該模型可以充分解釋響應(yīng)中的變異，模型的擬合效果良好，實(shí)驗(yàn)誤差小，因此，該回歸模型可以用來(lái)對(duì)花椒籽蛋白抗菌肽的抑菌活性進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

在該模型中，回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)顯示，一次項(xiàng)X1、X2、X3，平方項(xiàng)X12、X22、X42，交互項(xiàng)X1X2、X1X4、X2X3、X2X4的影響均達(dá)到極顯著水平；平方項(xiàng)X32，交互項(xiàng)X3X4的影響達(dá)到顯著水平。由方差分析可知，研究范圍內(nèi)的4個(gè)因素對(duì)花椒籽蛋白抗菌肽的抑菌率大小順序?yàn)椋旱孜餄舛龋久概c底物比＞pH＞酶解溫度。

綜合上述分析結(jié)果，剔除模型中不顯著的項(xiàng)，得到花椒籽蛋白抗菌肽的抑菌率預(yù)測(cè)的二次多元回歸模型為：

表3 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Experimental design and results for MSR

2.3.2 因素間的交互作用 用Desigh-Expert軟件對(duì)4因素間的交互作用進(jìn)行全面的模型分析，并對(duì)交互作用影響顯著的兩因素繪制響應(yīng)面曲線圖。

圖7 底物濃度和酶與底物比對(duì)花椒籽蛋白多肽抑制大腸桿菌效果的響應(yīng)曲面圖Fig.7 3-D surface plot for effect of substrate concentration vs. enzyme/substrate ratio on inhibitory rate to E.coli

由圖7可見(jiàn)，隨著底物濃度和酶與底物比的增加，酶解液的抑菌活性都呈現(xiàn)先增大后降低的趨勢(shì)。當(dāng)酶與底物比過(guò)大時(shí)，較少的底物能與蛋白酶完全結(jié)合，隨著底物濃度的增大，酶解液的抑菌活性增強(qiáng)；當(dāng)?shù)孜餄舛冗^(guò)大時(shí)，酶在反應(yīng)體系中的濃度相對(duì)較低，蛋白酶更易解離為單體，常比多聚體更易失活[15]，從而使酶解液的抑菌活性降低。

表4 方差分析結(jié)果Table 4 Results of analysis of variance

圖8 底物濃度和酶解溫度對(duì)花椒籽蛋白多肽抑制大腸桿菌效果的響應(yīng)曲面圖Fig.8 3-D surface plot for effect of substrate concentration vs. hydrolysis temperature on inhibitory rate to E.coli

由圖8可見(jiàn)，當(dāng)酶解溫度一定時(shí)，隨著底物濃度的增加，酶解液的抑菌活性呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。當(dāng)?shù)孜餄舛忍幱诘退綍r(shí)，酶解物的抑菌活性隨著溫度的升高而增大，后趨于平緩；當(dāng)?shù)孜餄舛忍幱诟咚綍r(shí)，酶解物的抑菌活性隨著酶解溫度的升高而逐漸降低。

圖9 酶與底物比和pH值對(duì)花椒籽蛋白多肽抑制大腸桿菌效果的響應(yīng)曲面圖Fig.9 3-D surface plot for effect of enzyme/substrate ratio vs. pH value on inhibitory rate to E.coli

由圖9可知，無(wú)論pH處于何種水平，隨著酶與底物比的增大，酶解液的抑菌活性呈現(xiàn)先增大后降低的趨勢(shì)。在酶與底物比低水平時(shí)，酶解液的抑菌活性隨pH的變化較小；在酶與底物比高水平時(shí)，酶解液的抑菌活性隨著pH的增加而逐漸增大。

由圖10可見(jiàn)，無(wú)論酶解溫度處于何種水平，酶解物的抑菌活性隨著酶與底物比的增大呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。當(dāng)酶與底物比處于低水平時(shí)，酶解物的抑菌活性隨著酶解溫度的升高呈現(xiàn)緩慢的上升趨勢(shì)；當(dāng)酶與底物比處于高水平時(shí)，酶解物的抑菌活性隨酶解溫度的升高而緩慢降低，在0水平值以后，抑菌活性降低速度加快，這可能是溫度升高，造成蛋白酶的構(gòu)象變化，蛋白酶出現(xiàn)部分失活或變性，導(dǎo)致酶解液對(duì)大腸桿菌的抑菌活性降低。

由圖11可見(jiàn)，無(wú)論酶解溫度處于何種水平，隨著pH的增加，酶解液的抑菌活性明顯增加。當(dāng)pH處于低水平時(shí)，酶解液的抑菌活性隨著溫度的升高呈現(xiàn)先增大后降低的趨勢(shì)；當(dāng)pH處于高水平時(shí)，隨著酶解溫度的升高，酶解液的抑菌活性變化不明顯，在溫度為0水平值左右時(shí)，抑菌活性出現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)。2.3.3 擬合優(yōu)化的驗(yàn)證 通過(guò)響應(yīng)面的數(shù)字最優(yōu)組合分析可得到胃蛋白酶水解花椒籽蛋白的最佳酶解條件為：底物濃度4.91%、酶與底物比0.88∶100、pH2.00、酶解溫度32.00℃、酶解時(shí)間3h，在此優(yōu)化條件下，酶解產(chǎn)物對(duì)大腸桿菌抑菌率的理論值為61.83%。結(jié)合實(shí)際條件，最終選擇實(shí)驗(yàn)條件為底物濃度4.9%、酶與底物比0.9∶100、pH2.0、酶解溫度32℃、酶解時(shí)間3h，實(shí)際測(cè)得酶解產(chǎn)物的抑菌率達(dá)到60.96%，與理論值61.83%相比，相對(duì)誤差為1.40%，說(shuō)明采用響應(yīng)面法優(yōu)化胃蛋白酶制備花椒籽蛋白抗菌肽的酶解工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，本實(shí)驗(yàn)建立的模型在實(shí)際應(yīng)用中是可行的。

圖10 酶與底物比和酶解溫度對(duì)花椒籽蛋白多肽抑制大腸桿菌效果的響應(yīng)曲面圖Fig.10 3-D surface plot for effect of enzyme/substrate ratio vs. hydrolysis temperature on inhibitory rate to E.coli

圖11 pH和酶解溫度對(duì)花椒籽蛋白多肽抑制大腸桿菌效果的響應(yīng)曲面圖Fig.11 3-D surface plot for effect of pH value vs. hydrolysis temperature on inhibitory rate to E.coli

3 結(jié)論

本研究結(jié)果以大腸桿菌為指示菌，采用Box-Behnken響應(yīng)面的設(shè)計(jì)原理得到了胃蛋白酶制備花椒籽蛋白抗菌肽的最佳工藝條件為：底物濃度4.9%、酶與底物比0.9∶100、pH2.0、酶解溫度32℃、酶解時(shí)間3h，在此條件下獲得的酶解產(chǎn)物對(duì)大腸桿菌的抑菌率為60.96%。驗(yàn)證結(jié)果表明，該模型準(zhǔn)確可靠，具有很好的預(yù)測(cè)能力。

在本研究中，用胃蛋白酶制備花椒籽蛋白所得抗菌肽復(fù)合物對(duì)大腸桿菌的抑菌率不是很高，后續(xù)工作應(yīng)對(duì)酶解產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)一步地分離純化，在能提高抗菌肽抑菌活性的同時(shí)，也為花椒籽蛋白抗菌肽應(yīng)用到食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域提供一定參考。同時(shí)胃蛋白酶制備的花椒籽蛋白抗菌肽對(duì)大腸桿菌有抑菌活性，但其抑菌機(jī)理尚未清楚，還有待進(jìn)一步研究。

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Optimization of antibacterial peptides preparation using pepsin from prickly ash seed protein by response surface methodology

JIANG Tai-ling，WU Hong-yang，WANG Wei，ZHANG Zhi-qing*
（College of Food Science，Sichuan Agricultural University，Ya’an 625014）

Prickly ash seed protein was hydrolyzed by pepsin for antibacterial peptides preparation.Onefactor-at-a-time method and response surface analysis based on Box-Behnken design，using four factors and three levels of response surface methodology to analyzed each factor.The inhibitory rate on Escherichia coli in response to the value of establishing mathematical model and the optimal hydrolysis condition was substrate concentration 4.9% ，enzyme/substrate ratio （g/g ） 0.9 ∶100 ，pH2.0 ，hydrolysis temperature 32℃ and hydrolysis time 3h.Under these conditions ， the obtained hydrolysate showed an inhibitory rate as high as 60.96%.

prickly ash seed protein；pepsin；antibacterial peptide；response surface analysis

TS201.2

A

1002-0306（2014）20-0226-06

10.13386/j.issn1002-0306.2014.20.041

2014－02－12

姜太玲（1989-），女，碩士研究生，研究方向：功能性食品。

* 通訊作者：張志清（1976-），男，博士，教授，研究方向：糧油副產(chǎn)物開(kāi)發(fā)利用。