云南半細(xì)毛羊毛囊干細(xì)胞表面標(biāo)記物的鑒定

李東江，權(quán)國波，楊紅遠(yuǎn)，呂春榮，洪瓊花

（云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，昆明 650224）

遺傳育種

云南半細(xì)毛羊毛囊干細(xì)胞表面標(biāo)記物的鑒定

李東江，權(quán)國波，楊紅遠(yuǎn)，呂春榮，洪瓊花

（云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，昆明 650224）

設(shè)計(jì)8對(duì)引物（CK14、CK15、CK19、CD34、CD271、CD200、nestin和β1），分別擴(kuò)增云南半細(xì)毛羊成纖維細(xì)胞和毛囊干細(xì)胞表面標(biāo)記物。結(jié)果表明：在成纖維細(xì)胞中CK19和β1表現(xiàn)為陽性，而在毛囊干細(xì)胞中CK14、CK19和β1表現(xiàn)為陽性，其他標(biāo)記物的表達(dá)都為陰性。因此，CK14可以作為鑒定云南半細(xì)毛羊毛囊干細(xì)胞的表面標(biāo)記物之一。

云南半細(xì)毛羊；毛囊干細(xì)胞；表面標(biāo)記物

毛囊為包圍在毛發(fā)根部的囊狀組織，由上皮和真皮兩部分組成，是控制毛發(fā)生長的皮膚附屬器官。毛囊干細(xì)胞（hair follicle stem cells,hFSCs）是定位于毛囊隆突區(qū)（即皮脂腺開口處與立毛肌毛囊附著處之間的毛囊外根鞘）的一類成體干細(xì)胞［1］。毛囊干細(xì)胞是毛囊中的原始細(xì)胞，其分化經(jīng)毛囊干細(xì)胞、短暫增殖細(xì)胞（transit amplifying cells，TAC）和有絲分裂后分化細(xì)胞（postmitotic differentiatingcells，PDC）3個(gè)階段，在體內(nèi)表現(xiàn)為自我更新能力和慢周期性,體外培養(yǎng)時(shí)表現(xiàn)出高克隆能力和多分化潛能［2］。毛囊干細(xì)胞自我更新能力強(qiáng),具有多分化潛能,易于獲取,是干細(xì)胞生物學(xué)和組織工程研究的理想模型之一,具有廣泛的臨床應(yīng)用前景，是近幾年國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。

hFSCs的標(biāo)記物不僅可以為hFSCs的鑒定提供依據(jù)，還是分離獲得高純度hFSCs的前提，同時(shí)也是對(duì)hFSCs的分子生物學(xué)機(jī)制進(jìn)行深入研究的基礎(chǔ)［3］。然而，目前關(guān)于綿羊毛囊干細(xì)胞標(biāo)志物尚存在爭議。本課題組前期已經(jīng)初步建立了云南半細(xì)毛羊毛囊干細(xì)胞系，本試驗(yàn)旨在通過檢測CK14、CK19和β1等8個(gè)基因在毛囊干細(xì)胞的表達(dá)情況，確定云南半細(xì)毛羊毛囊干細(xì)胞系的特異性標(biāo)志物，為后續(xù)的hFSC定向分化以及毛囊發(fā)育調(diào)控機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

云南半細(xì)毛羊由昆明易興恒畜牧科技有限責(zé)任公司種羊場提供；試驗(yàn)用組織塊取自成年羊背部皮膚和耳尖。

1.2 試劑和試劑盒

胰蛋白酶和青鏈霉素溶液（PS）購自Bioind公司；DMEM/F12和B27購自Gibco公司；堿性成纖維細(xì)胞生長因子（β-FGF）購自PEPROTECH公司?？俁NA提取試劑盒：SV Total RNA Isolation System（Promega，USA）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒：Reverse Transcription System（Promega，USA）；DNA膠回收試劑盒DNA marker、Taq DNA聚合酶均

購自寶生物工程（大連）有限公司；擴(kuò)增產(chǎn)物送交上海生工進(jìn)行測序。其余所有試劑均購自Sigma公司。

1.3 hFSCs系建立

取云南半細(xì)毛羊成年羊背部皮膚樣本0.5cm×0.5 cm，75%酒精浸泡2 min，然后用生理鹽水+1%青鏈霉素溶液洗3次，用柳葉刀刮去皮膚表面污物。用手術(shù)剪和鑷子把皮膚剪成0.1 cm×0.1 cm的小塊。將皮膚塊在緩沖液（DMEM-F12+1%PS）中洗3次。在體視鏡下用眼科鑷子將毛囊從皮膚拔出。將拔出的毛囊收集到一起，在緩沖液中洗滌3次后，移入12孔板中，每孔4～6根，加入0.5 mL培養(yǎng)液。最后將毛囊組織放入培養(yǎng)箱（37℃，5% CO2，飽和濕度）中培養(yǎng)。培養(yǎng)液組成：DMEM-F12+bFGF 40ng/mL+EGF20ng/mL+B2720μL/mL+1%PS。

1.4 成纖維細(xì)胞系建立

從消毒去毛后的云南半細(xì)毛羊耳尖剪取0.5 cm2大小的皮塊，置于4℃保存液中，在2 h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行培養(yǎng)。保存液為DMEM＋10%FBS＋200 IU/mL青霉素＋200 IU/mL鏈霉素。在無菌條件下，將組織塊用生理鹽水液反復(fù)洗滌3次，然后用眼科剪剪成碎塊，置于直徑50 mm的培養(yǎng)皿中，每皿10塊進(jìn)行培養(yǎng)。所用培養(yǎng)液為DMEM添加10%FBS，在5%CO2、飽和濕度和37.0℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞長出后開始換液，之后每3天換液1次。待培養(yǎng)皿基本鋪滿單層細(xì)胞，去除培養(yǎng)液添加胰蛋白酶-EDTA（TE）消化液控時(shí)控溫消化。在成纖維細(xì)胞離壁前添加含有血清的培養(yǎng)液終止消化，制成細(xì)胞懸液，再移至離心管中，經(jīng)1 600 r/min離心5 min后棄上清，按照傳代前與傳代后1∶2的細(xì)胞數(shù)目比例對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，每隔24 h進(jìn)行換液。等細(xì)胞匯合度達(dá)到80%～90%時(shí)，進(jìn)行下一次傳代。原皿中貼壁較緊的細(xì)胞，可換液繼續(xù)培養(yǎng)。

1.5 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中綿羊CK14、CK19、CK15、CD34、CD271、CD200、nestin和β1基因mRNA序列，設(shè)計(jì)8對(duì)基因的引物。引物序列見表1，由上海生工合成。

表1 引物序列及其擴(kuò)增片段

1.6 基因擴(kuò)增

1.6.1RNA提取 將培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)瓶取出，用PBS洗滌細(xì)胞2次，加入1 mL的胰酶溶液，晃動(dòng)容器使胰酶分布均勻，待到細(xì)胞松動(dòng)，盡快除去胰酶溶液，用PBS沖洗細(xì)胞，把細(xì)胞收集到無菌離心管中，500×g離心5 min，棄上清。向細(xì)胞沉淀中加入175 μLRNA裂解液，混合均勻。然后取175 μL裂解物加入350 μL DNA Dilution Buffer，顛倒試管3～4次，在70℃水浴中孵育3 min。在20～25℃,12 000 g離心10 min。用移液槍將上清液移到一無菌離心管中，向上清液中加入200 μL95%乙醇，用移液槍吸放3～4次以混合。將此混合物轉(zhuǎn)移到離心柱裝配體中，12 000 g離心1 min。從離心柱裝配體上拿下離心柱，棄去收集管中的液體，加600 μLRNAWash Solution于離心柱裝配體，12 000 g離心1 min。清空收集管，向裝配體中加入50 μL的DNase孵育混合物，輕輕吸放均勻。于20～25℃孵育15 min，然后向離心柱中加入200 μL DNase Stop Solution，12 000 g離心1 min，再加入600 μL RNAWash Solution，高速離心2 min。取出一個(gè)1.5 mL帶蓋洗脫管，將離心柱從收集管上轉(zhuǎn)移到洗脫管中，向膜上加100 μL無核酸酶水，12 000 g離心1 min，丟棄離心

柱，蓋好盛有RNA的洗脫管，保存于-70℃冰箱。

1.6.2 反轉(zhuǎn)錄 按反轉(zhuǎn)錄試劑盒Reverse Transcription System的說明進(jìn)行操作。在試驗(yàn)前，先將1 μg的RNA加入微量離心管中，并于70℃溫育10 min，短暫離心后置于冰上。反轉(zhuǎn)錄體系：MgCl2（25 mM）4 μL，反轉(zhuǎn)錄10×緩沖液2 μL，dNTP混合液2 μL，重組RNasin 0.5 μL，AWV反轉(zhuǎn)錄酶1.5 μL，OligodT引物1 μL，RNA5 μL，無RNA酶蒸餾水4μL。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：42℃15min；95℃5 min；4℃5 min。cDNA于-20℃下備用。

1.6.3PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系：cDNA 2 μL，dNTP 2 μL，10×緩沖液（已加MgCl2）2.5 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，Taq酶0.5 μL，滅菌蒸餾水16 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2 min；94℃30 s，56℃30 s，72℃80 s，共25個(gè)循環(huán)；4℃保存。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

2 結(jié)果與分析

各標(biāo)志物基因的表達(dá)電泳分析情況見圖1和表2?？梢钥闯?，用毛囊干細(xì)胞來擴(kuò)增表面標(biāo)記物，CK14、CK19和β1為陽性，其他都為陰性。而用成纖維細(xì)胞來擴(kuò)增表面標(biāo)記物，只有CK19和β1為陽性，其他都為陰性。對(duì)比可以看出，在所選擇的8個(gè)表面標(biāo)記物中，CK14可以作為從分子水平上區(qū)別毛囊干細(xì)胞和體細(xì)胞的特異性標(biāo)志物。

圖1 擴(kuò)增毛囊干細(xì)胞和成纖維細(xì)胞表面標(biāo)記物電泳圖

表2 毛囊干細(xì)胞與成纖維細(xì)胞RT-PCR鑒定結(jié)果

3 討論

毛囊干細(xì)胞的標(biāo)志物比較復(fù)雜，物種、存在部位，甚至細(xì)胞分離技術(shù)的不同而有差異［4］。整合素是介導(dǎo)胞外基質(zhì)黏連、調(diào)節(jié)分化的重要因子。Jones等［5］的研究提示,整合素β1是表皮干細(xì)胞的標(biāo)志之一，但Tumbar［6］的研究則發(fā)現(xiàn)β1在某些不具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞中也能高表達(dá)。本試驗(yàn)的結(jié)果證實(shí)了Tumbar［6］的觀點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)整合素β1在云南半細(xì)毛羊的毛囊干細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中都有表達(dá)。角蛋白是表皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)蛋白,可用于鑒別表皮干細(xì)胞、暫時(shí)增殖細(xì)胞和終末分化細(xì)胞。表皮干細(xì)胞表達(dá)CK19，暫時(shí)增殖細(xì)胞（TA細(xì)胞）表達(dá)CK5和CK14，而終末分化細(xì)胞主要表達(dá)CK1和CK10。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在毛囊干細(xì)胞中CK14和CK19都為陽性，在對(duì)照組成纖維細(xì)胞中CK19為陽性，而CK14為陰性，這與徐紅［7］對(duì)人成纖維細(xì)胞和毛囊干細(xì)胞標(biāo)志物的研究結(jié)果一致。上述結(jié)果可能是因CK19和波形蛋白（vimentin）具有同源性，RT-PCR鑒定時(shí)CK19基因出現(xiàn)假陽性所致。但CK14卻特異性地在毛囊干細(xì)胞中表達(dá)，所以可以選用CK14作為標(biāo)志物來分選云南半細(xì)毛羊毛囊干細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。造血干細(xì)胞標(biāo)志物CD34也是公認(rèn)的毛囊干細(xì)胞。CD34是鼠毛囊干細(xì)胞的標(biāo)志物，但Ohyama等［8］提示CD34不能用來分離人毛囊干細(xì)胞。本試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)CD34也不能用來分離云南半細(xì)毛羊毛囊干細(xì)胞。

本試驗(yàn)首次對(duì)云南半細(xì)毛羊毛囊干細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)情況進(jìn)行了初步分析，同時(shí)以皮膚來源的成纖維細(xì)胞作為對(duì)照。結(jié)果表明，CK14在綿羊毛囊干細(xì)胞中特異性表達(dá)，可作為毛囊干細(xì)胞分選的標(biāo)志物。

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Identification of Hair Follicle Stem Cell Surface Markers From Yunnan Semi-wool Sheep

Li Dong-jiang，Quan Guo-bo，HongQiong-hua，et al
（Yunnan AcademyofAnimal and VeterinarySciences，Kunming650224，China）

Eight paris of primers（CK14，CK15，CK19，CD34，CD271，CD200，nestin and β1）were designed to amplify surface markers of hair follicle stem cells and fibroblast cells from Yunnan semi-wool sheep，the results showed that CK19 and β1 performed positive in fibroblast cells，CK14，CK19 and β1 performed positive in hair follicle stem cells，the expression ofother markers were negative，soCK14 could be used as one ofthe surface markers toidentifyfollicle stemcells ofYunnan semi-wool sheep.

Yunnan semi-wool sheep；hair follicle stemcell；surface marker

S826.2

A

2095-3887（2014）01-0005-03

10.3969/j.issn.2095-3887.2014.01.001

2013-10-31

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)（CARS-40）；云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究青年項(xiàng)目（2012FD083）

李東江（1982-），男，助理研究員。

洪瓊花，研究員，碩士生導(dǎo)師。