基質金屬蛋白酶-9在聲帶息肉中的表達

寧金梅，吳 平，趙樹波，劉德華，楊明早，朱 媛，孫 勇

（1．曲靖市第一人民醫(yī)院 耳鼻咽喉科，云南 曲靖 655000；2．昆明醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院 耳鼻喉科，云南 昆明 650101）

近年來隨著生活水平的提高，嗓音疾病漸漸被人重視。聲帶息肉是臨床上的常見病及多發(fā)病，多見于成人，男女均可發(fā)病，是引起聲音嘶啞的常見原因之一。常發(fā)生于一側聲帶前、中三分之一交界處的邊緣，有蒂或廣基，也可雙側均發(fā)生。隨著社會交流的增多，環(huán)境污染問題的加劇，其發(fā)病率有明顯上升趨勢，直接影響人們的生理和心理健康。聲帶的結構分為鱗狀上皮層、固有層淺層、固有層中層、固有層深層和聲帶肌層五層。任克氏間隙（Reinke'sspace）是位于聲帶上皮下與聲韌帶之間的一個柔軟的、含有無定形物質的潛在間隙，其形態(tài)和張力決定了聲帶的振動特點，是一個具有高度特異性的結締組織屏障，全層幾乎沒有淋巴引流，主要為細胞外基質（extracellular matrix,ECM）和成纖維細胞（fibroblast,Fb），是聲帶息肉的好發(fā)部位。聲帶息肉的發(fā)病原因有以下學說：⑴吸煙；⑵循環(huán)障礙學說；⑶炎癥學說；⑷機械創(chuàng)傷學說；⑸內分泌紊亂；⑹變態(tài)反應。另外，近年來臨床研究發(fā)現特殊類型的聲帶息肉與胃食管反流發(fā)生有著密切關系，胃食管反流的反流物含有不同成分，其中胃酸和胃蛋白酶是損傷咽喉粘膜的主要成分，長期刺激咽喉組織，引起聲帶彌漫性充血水腫，嚴重時出現聲帶小結、聲帶息肉。導致聲帶息肉的形成可能是多方面因素共同作用的結果，而其中某一方面起主導作用。但是什么因素作用導致聲帶結構的改變，生成息肉，并不是十分清楚。

MMP-9能有效降解明膠和基膜的主要成分Ⅳ，Ⅴ，Ⅶ，Ⅹ型膠原，其高表達可導致細胞外基質和血管基底膜降解加速，在多種炎癥性和腫瘤性疾病致病過程中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現MMP9的基質降解作用比MMP2高出近25倍，MMP9在粘膜內胃癌轉移中的作用比MMP2更強[1-4]。目前已證實，高表達的MMP-9與腫瘤血管生成、細胞增殖、凋亡抑制、細胞免疫抑制等都有十分密切的關系，所以研究聲帶息肉中MMP-9的表達也許可以為研究聲帶息肉的發(fā)生機制提供一些線索。

材料與方法

一、臨床資料 實驗組：選擇近年聲帶息肉患者標本35例，其中男性22例，女性13例，年齡24-62歲，平均年齡為41歲，病程1月至8年，均經病理診斷確診，且排除其他聲帶病變。所有患者均為初次手術。對照組：正常聲帶組織標本18例（因非喉部疾病死亡24-48h內的尸體標本，或病理科保存的正常聲帶組織標本蠟塊）。

二、試驗方法：2組標本經10%甲醛固定，石蠟包埋，作4μm厚的連續(xù)切片，HE染色，選取標本中細胞成分多的部位作切片進行免疫組織化學染色。

三、結果判斷 陽性判斷標準：與邁新公司的陽性對照片中陽性細胞相比。相同或比其深者為陽性，比其弱或沒有染色者為陰性。MMP-9以細胞漿出現黃色為陽性細胞，將每張切片著色強度與著色細胞數量進行分級。陽性細胞計數：0～5%為差，6%～15%為±，16%～25%為+，26%～50%為++，>50%為+++。陽性細胞表達強度：差無著色或染色與邁新公司的陽性對照片中陽性細胞相比比其弱，+黃色，++棕黃色，+++棕色。

四、圖像定量分析 應用Nikon Eclipse 50i計算機圖像分析儀，在400倍鏡下對行MMP-9染色的切片每張隨機選取3個視野的上皮細胞和相鄰的細胞間質。因聲帶息肉病理組織學變化多樣，為增加研究的可比性，在MMP-9的連續(xù)切片中，選取的視野相同。用Nikon Mivnt顯微圖像分析軟件（WindowsXP版），每個視野隨機圈定3個陽性單位（3個陽性細胞的細胞質），測定這3個陽性單位均值代表該視野的陽性單位均值。用陽性單位均值表示被染色物質的多少，陽性單位均值越大，說明物質的相對含量越高，即抗原物質表達的水平越高，反之亦然。

結 果

一、免疫組化觀察結果 MMP-9在正常聲帶組中，陽性反應主要位于炎性細胞、成纖維細胞和上皮細胞。不同的標本中各種細胞的表達可不一樣，常以某一種細胞的表達為主，表達計數大多為+，強度多為+～++。也表達于血管內皮細胞、橫紋肌和軟骨細胞見圖1。在聲帶息肉組中，幾乎所有切片上皮細胞、成纖維細胞、炎性細胞、和血管內皮細胞都明顯表達MMP-9。在上皮細胞的表達：計數和表達強度均在+～++之間；在成纖維細胞的表達：計數大多為+～+++，表達強度大多為++；在炎性細胞的表達：計數多為+～+++，表達強度大多為++；在血管內皮細胞的表達：計數多為+～+++，表達強度大多為++見圖2-5。

二、統(tǒng)計結果 正常聲帶和聲帶息肉組間MMP-9陽性單位均值比較有統(tǒng)計學差異見附表，聲帶息肉組陽性單位均值（42.9661±9.8012）高于正常聲帶組（16.6147±8.4834）。

圖1 MMP-9在正常聲帶組織固有層中的表達，主要著色于纖維細胞和炎性細胞（免疫組化MaxVision TM法，×200）

圖2 MMP-9在聲帶息肉組織中的表達，主要著色于炎性細胞和血管內皮細胞（免疫組化MaxVisionTM×200）

圖3 MMP-9在聲帶息肉組織中的表達，主要著色于上皮細胞和纖維細胞（免疫組化MaxVisionTM法，×200）

圖4 MMP-9在聲帶息肉組織中的表達，主要著色于纖維結締組織和血管壁（免疫組化MaxVisionTM法，×400）

圖5 MMP-9在聲帶息肉組織中的表達，主要著色于血管內皮細胞（免疫組化MaxVisionTM法，×200）

討 論

本文在光鏡下觀察到，聲帶息肉組中多數息肉被覆鱗狀上皮不同程度增生，表面可見輕到中度角化或角化過度。部分病例棘細胞水樣變性。間質可見，結構疏松，不同程度水腫，炎性細胞浸潤，毛細血管密集、擴張、充血，含鐵血黃素沉著，纖維細胞增生，玻璃樣變性等。以上改變可以某種為主或共同存在。固有層結締組織排列紊亂，層狀結構消失，可見少量腺體增生。炎性細胞數量較正常聲帶組織多。這也說明聲帶息肉的形成過程中存在著炎癥反應。

附表 正常聲帶和聲帶息肉MMP-9陽性單位均值比較

已進行了大量關于MMPs在生理和病理情況下組織重塑方面生物學行為的研究，MMPs能降解細胞外基質、基底膜和其它蛋白，同時降低細胞免疫力。Malinsky等[5]研究發(fā)現：MMP-2 and MMP-9在鼻息肉中的表達顯著高于對照組（中鼻甲）；慢性鼻竇炎合并鼻息肉的患者中，MMP-2 and MMP-9 mRNA基因的表達顯著高于對照組。Yigit等[6]研究得出結論：鼻息肉的嚴重程度主要與MMP-2/TIMP-1 增 加 有 關 ，其 次 是MMP-9/TIMP-1。因此，對于鼻息肉病人，選擇性抑制MMP-2或MMP-9，活化TIMP-1可能是一種新的治療方案。Yeo等[7]研究報告：MMP-9在鼻息肉中的表達高于對照組（下鼻甲粘膜），在復發(fā)性鼻息肉中的表達也顯著高于鼻息肉組，特別是在基質中的表達。由此得出結論，MMP-9可能與鼻息肉的復發(fā)有關。Wang等[8]研究得出結論：不被TIMP-1抑制的MMP-9 mRNA的顯著上調，促進了經呼吸道感染病毒的蛋白水解活動，這可能使慢性鼻竇炎合并鼻息肉患者的病變進一步進展。國外學者Karahan等[9]在聲帶息肉的研究中顯示：和正常聲帶相比，MMP-2，MMP-9在聲帶息肉間質梭形細胞和血管壁的表達顯著增強。在我們的實驗中，MMP-9在正常聲帶和聲帶息肉中均呈程度不一的陽性反應。在正常聲帶中，MMP-9陽性反應主要位于炎性細胞、成纖維細胞和上皮細胞，不同的標本中各種細胞的表達可不一樣，常以某一種細胞的表達為主。幾乎所有聲帶息肉切片上皮細胞、成纖維細胞、炎性細胞、和血管內皮細胞都明顯表達MMP-9。聲帶息肉組MMP-9染色較正常聲帶組深，經圖像定量分析，正常聲帶和聲帶息肉組間MMP-9陽性單位均值比較均有統(tǒng)計學差異，聲帶息肉組MMP-9陽性單位均值(42.9661±9.8012)，高于正常聲帶組（16.6147±8.4834）。

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