清熱降壓膠囊干預(yù)SHR海馬區(qū)組織代謝組學(xué)研究

蔣海強(qiáng)+聶磊+李運(yùn)倫+王苗苗+朱梅+楊雯晴+張新雅

[摘要] 選取30只SHR大鼠隨機(jī)分為3組模型組，卡托普利組，清熱降壓膠囊組，wistar大鼠10只作為正常對照組，連續(xù)給藥14 d后取海馬組織，采用核磁共振（¹H-NMR）代謝組學(xué)方法探討高血壓大鼠的海馬組織損傷以及清熱降壓膠囊的保護(hù)作用。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)卡托普利組海馬區(qū)代謝輪廓明顯異于其余3組，另3組大鼠樣本分類的趨勢非常明顯，提示清熱降壓膠囊能顯著改善大鼠海馬組織的代謝，鑒定4種代謝產(chǎn)物為二甲基甘氨酸、甘油磷酸膽堿、醛固酮和去甲腎上腺素。高血壓大鼠機(jī)體代謝異常主要表現(xiàn)在酪氨酸代謝、血管平滑肌收縮以及醛固酮控制的鈉鹽再吸收失常，清熱降壓膠囊在有效降壓的同時(shí)通過影響這些代謝產(chǎn)物來改善高血壓的海馬區(qū)損傷。

[關(guān)鍵詞] 高血壓病；清熱降壓膠囊；代謝組學(xué)；海馬

[收稿日期] 2013-07-07

[基金項(xiàng)目] 國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81273700）；國家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目（81102549）

[通信作者] *李運(yùn)倫，Tel：13869102760，E-mail：li.yunlun@163.com 高血壓?。╡ssential hypertension）是臨床常見病，多發(fā)病，高血壓所導(dǎo)致的小動脈病變可造成腦內(nèi)血流減少，供血區(qū)腦組織缺血缺氧，從而影響學(xué)習(xí)和記憶能力[1]。因此對于高血壓的治療不僅是血壓達(dá)標(biāo)，更多的是對腦組織損傷的保護(hù)。在長期高血壓的情況下，中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能也會發(fā)生改變，研究表明自發(fā)性高血壓大鼠4月齡時(shí)海馬CA1區(qū)和齒狀回區(qū)白質(zhì)容積減少，6月齡時(shí)海馬CA1區(qū)和齒狀回區(qū)灰質(zhì)容積及神經(jīng)元數(shù)目減少[2]。因此，高血壓大鼠海馬區(qū)可能存在相應(yīng)的損傷，在高血壓治療的同時(shí)具有保護(hù)海馬區(qū)功能的制劑可能具備良好的開發(fā)前景。

清熱降壓膠囊作為山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院的醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑，適用于高血壓病肝火上炎證，其藥味包括黃連、鉤藤、澤瀉和蘆薈，前期研究發(fā)現(xiàn)其具有良好的抗高血壓作用，其機(jī)制與降低血漿 Renin 和 AngⅡ含量、提高血漿 cAMP 濃度和降低血容量有關(guān)[3]，能夠干預(yù)高血壓大鼠血漿代謝組整體代謝模式向正常模式轉(zhuǎn)化[4]，因此本實(shí)驗(yàn)采用核磁共振代謝組學(xué)技術(shù)，從海馬組織小分子代謝物層次研究清熱降壓膠囊對高血壓大鼠海馬區(qū)的保護(hù)和逆轉(zhuǎn)損傷作用，應(yīng)用模式識別技術(shù)分析海馬區(qū)的潛在代謝標(biāo)志物，結(jié)合相應(yīng)代謝途徑，從高血壓大鼠海馬區(qū)損傷入手，分析清熱降壓膠囊的靶器官保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 動物 8周齡雄性自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneously hypertensive rat，SHR）30只，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，合格證書SCXK（京）2006-0009；8周齡雄性Wistar大鼠10只，購自山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，合格證書SCXK（魯）2005-1015。

1.2 儀器及試劑 AVANCEⅡ600MHz型超導(dǎo)傅立葉變換NMR譜儀，瑞士BRUKER公司產(chǎn)品。清熱降壓膠囊（魯藥制字Z20120009）；卡托普利片（濟(jì)南東風(fēng)制藥有限公司，批號0608023）；重水（D₂O）為美國CIL公司產(chǎn)品，2，2，3，3-三甲基甲硅烷基丙酸（3-trimethylsilyl-[2，2，3，3-D4]-propionate，TSP），美國Aldrich公司產(chǎn)品。

1.3 分組及給藥方法 將SHR大鼠隨機(jī)分成3組，每組10只，即清熱降壓膠囊組、卡托普利組和模型組，并設(shè)Wistar大鼠10只作為正常對照組。清熱降壓膠囊組給與18.336生藥g·kg^-1（相當(dāng)于60 kg成年人每日劑量的20倍），卡托普利加生理鹽水適量2.08 g·L^-1混懸液，對照組給與卡托普利24.96 mg·kg^-1，模型組和正常對照組給與等量的生理鹽水，按等容積不同濃度的原則灌胃給藥，每天1次，連續(xù)用藥14 d。

1.4 海馬組織的采集及處理 10%水合氯醛（0.35 mL·100 g^-1）腹腔注射麻醉大鼠，麻醉成功后，迅速斷頭取腦，剪開頭皮，用止血鉗沿大鼠頭顱中央骨縫撬開，迅速分離腦組織，于冰上分離出海馬組織，將體積比為2∶2∶1的甲醇、氯仿和水（4 ℃）按（3 mL· g^-1組織）加入到冷凍的組織中，置組織勻漿管中勻漿3 min，重復(fù)提取2次，合并提取勻漿，將樣品置于4 ℃的冷凍離心機(jī)中以3 000 r·min^-1離心20 min，取上清液置多通道旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋干，以重水600 μL溶解，加入適量TSP作為內(nèi)標(biāo)，取上層清液550 μL置于5 mm核磁管中，使用AVANCEⅡ600 MHz型超導(dǎo)傅立葉變換NMR譜儀進(jìn)行測量。

1.5 NMR數(shù)據(jù)采集和處理 在超導(dǎo)傅立葉變換NMR譜儀上調(diào)用cpmgpr1d脈沖序列，該序列可以較好地去除血液中大分子的干擾，以TSP為化學(xué)位移參考峰位置，設(shè)為0，校正化學(xué)位移，對圖譜進(jìn)行相位校正和基線校正，將¹H譜按默認(rèn)值，從δ 10.0～0，以每段為0.04進(jìn)行分段并積分，扣除δ 4.5～5處重水中殘余H₂O的影響，共獲得235個(gè)化學(xué)位移小段和各化學(xué)位移對應(yīng)的積分值，以Excel文件貯存。

1.6 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)文件采用SIMCA-P軟件 （version 11.5， Umetrics AB， Umea， Sweden） 進(jìn)行主成分分析（principal components analysis，PCA）和偏最小二乘-判別分析（Partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）。根據(jù)PLS-DA分析的VIP圖，尋找對分類貢獻(xiàn)較大的變量（即化學(xué)位移），確定各組的共性代謝物和組間差異的潛在生物標(biāo)志物。采用MATLAB軟件（The MathWorks，Inc.）進(jìn)行方差分析（ANOVA）。endprint