外翻腸囊吸收成分與藥效相關(guān)研究吳茱萸湯治療偏頭痛的藥效物質(zhì)

潘學(xué)強(qiáng)+吳燕川+龔慕辛+許永崧+王智民+張啟偉+尚雅文+盧旭然+宋亞芳

[摘要] 吳茱萸湯是治療虛寒性偏頭痛的經(jīng)典方劑，其與偏頭痛治療相關(guān)的有效成分尚不明確。該實(shí)驗(yàn)采用大鼠外翻腸囊模型獲取10種吳茱萸湯的吸收樣品，以 HPLC-DAD對吳茱萸湯及外翻腸囊吸收樣品中9種成分進(jìn)行定量、半定量，得到各成分在湯中的含量及在腸囊中的累積吸收量。同時(shí)建立利血平化小鼠偏頭痛動物模型，在給予吳茱萸湯治療后測定腦組織內(nèi)5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT），去甲腎上腺素（noradrenaline，NE），多巴胺（dopamine，DA）及腦組織與血清內(nèi)一氧化氮（nitric oxide，NO）及其合成酶（nitricoxide synthase，NOS）的含量與活力。最后運(yùn)用偏最小二乘回歸法（partial least squares regression，PLSR）對各成分總吸收量與藥效指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)了外翻腸囊吸收成分中影響藥效的主要成分是檸檬黃素-3-O-β-D-葡萄糖苷（limocitrin-3-O-β-D-glucoside，Lcs），人參皂苷Rg₁（ginsenoside Rg₁，Rg₁），人參皂苷Rb₁（ginsenoside Rb₁，Rb₁）、吳茱萸苦素（rutaevine，Rv）、檸檬苦素（limonin，Li）、吳茱萸堿（evodiamine，Ev）及吳茱萸次堿（rutaecarpine，Ru），其中Rg₁，Rv，Ev及Ru對多數(shù)藥效指標(biāo)具有正向改善作用，可能是影響吳茱萸湯治療偏頭痛作用的主要成分。

[關(guān)鍵詞] 吳茱萸湯；偏頭痛；外翻腸囊吸收譜效相關(guān)；偏最小二乘回歸；藥效物質(zhì)

[收稿日期] 2013-08-17

[基金項(xiàng)目] 北京市教育委員會科技計(jì)劃面上項(xiàng)目（SQKM201210025011）；首都中醫(yī)藥研究專項(xiàng)重點(diǎn)課題項(xiàng)目（13ZY02）

[通信作者] *龔慕辛，博士，博士生導(dǎo)師，從事中藥復(fù)方物質(zhì)基礎(chǔ)研究，Tel：（010）83911632，E-mail：gongmuxin@126.com

[作者簡介] 潘學(xué)強(qiáng)，碩士研究生，E-mail：pxq_xq@163.com

吳茱萸湯出自《傷寒論》，現(xiàn)代臨床上主要用于治療多種頭痛[1]。全方由吳茱萸、生姜、人參及大棗4味中藥組成。曾有學(xué)者采用化學(xué)分析與藥理相結(jié)合的方法對其藥效物質(zhì)進(jìn)行研究[2-3]，但由于缺乏成分分析與治療偏頭痛相關(guān)藥效指標(biāo)的關(guān)聯(lián)，使其有效成分尚不明確，影響了質(zhì)量控制與治療作用的優(yōu)化。本實(shí)驗(yàn)將10種吳茱萸湯中的9種成分在外翻腸囊的累積吸收量與偏頭痛藥效指標(biāo)相關(guān)聯(lián)，采用PLSR進(jìn)行分析，并與吳茱萸湯譜效相關(guān)結(jié)果進(jìn)行對比，以發(fā)現(xiàn)吳茱萸湯吸收成分中影響藥效的主要成分，為其治療偏頭痛的藥效物質(zhì)研究提供參考。

1 材料

ALC-M組織-器官恒溫水浴系統(tǒng)（上海奧爾科特生物技術(shù)有限公司）；Agilent 1100系列高效液相色譜系統(tǒng)，Chemstation色譜工作站，含四元泵、自動進(jìn)樣器、DAD檢測器（Agilent公司）；ESA高效液相色譜系統(tǒng)，Coularry 工作站，含二元泵，自動進(jìn)樣器，電化學(xué)檢測器（ESA公司）；MG-2200氮吹儀（EYELA公司）；Silent Crusher M勻漿儀（ Heidolph公司）；3K15低溫高速離心機(jī)（Sigma公司）；UV-2450紫外可見分光光度計(jì)（SHIMADZU公司）；SpectraMax Plus 384酶聯(lián)免疫檢測儀（Molecular Devices公司）；DV215CD電子分析天平（Sartorius公司）；KQ-250超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

利血平注射液（廣東邦民制藥廠有限公司，批號100509）；琥珀酸舒馬普坦片（天津華津制藥有限公司，批號2F69151）；注射用青霉素鈉（中諾藥業(yè)有限公司，批號016110691）；NO測定試劑盒（批號20130206），NOS測定試劑盒（批號20130228），考馬斯亮藍(lán)試劑盒（批號20130216），均購自南京建成生物工程研究所；吳茱萸堿（批號110801-200908，純度99.7%），吳茱萸次堿（批號110801-201207，純度99.4%），檸檬苦素（批號110800-201205，純度88.5%），人參皂苷Rg₁（批號110703-201128，純度93.4%），人參皂苷Re（批號110754-201123，純度89.1%），人參皂苷Rb₁（批號110704-201223，純度95.9%），6-姜辣素（批號111833-201102，純度98.6%）對照品購自中國食品藥品檢定研究院；檸檬黃素-3-O-β-D-葡萄糖苷（自制，純度≥95%）；5-HT（批號N-5785-250MG），DA（批號H8502-5G），NE（批號H7752-250MG），3，4-二羥基芐胺（3，4-dihydroxybenzylamine，3，4-DHBA，批號16290-26-9，純度98%）對照品及內(nèi)標(biāo)物購自Sigma公司；乙腈（色譜純），甲醇（色譜純）購自Fisher公司。

Wistar大鼠，雄性，體重（300±20） g；ICR小鼠，雌雄各半，體重（30±2） g，均由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，合格證號SCXK（京） 2012-0001。

2 方法

2.1 吳茱萸湯樣品的制備

飲片來源及編號詳見表1。各飲片由首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院羅容教授鑒定，符合《中國藥典》（2010年）各藥項(xiàng)下規(guī)定。各藥味配伍見表2，按照文獻(xiàn)方法[4]進(jìn)行煎煮，藥液減壓干燥成干膏，復(fù)溶后測定其中9種成分含量。endprint

表1 吳茱萸湯中4種飲片來源及編號

Table 1 Sources and numbers of 4 medicinal materials in Wuzhuyu Tang

注：^1）WZY為吳茱萸；^2）SJ為生姜；^3）DZ為大棗；^4）RS為人參。

2.2 Tyrode緩沖液的配制

按照文獻(xiàn)方法[5]配制。

2.3 色譜方法

2.3.1 色譜條件 Kromasil-C₁₈柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），甲醇-乙腈-水梯度洗脫（0～5 min，1∶16∶83；5～10 min，1∶16∶83～1∶19∶80；10～45 min，1∶19∶80～4∶19∶77；45～55 min，4∶19∶77～4∶25∶71；55～65 min，4∶25∶71～4∶34∶62；65～110min，4∶34∶62），柱溫30 ℃，檢測波長203 nm，流速1 mL·min^-1。

2.3.2 選擇性試驗(yàn) 比較空白Tyrode緩沖液、混合對照品溶液、吳茱萸湯Tyrode緩沖液、吳茱萸湯各缺味陰性Tyrode緩沖液的色譜行為。在本實(shí)驗(yàn)色譜條件下，8種對照品峰形良好，各峰分離度高，空白緩沖液、各陰性對照液和吳茱萸湯中其他成分對其無干擾，說明方法選擇性較好，結(jié)果見圖1。

表2 10種吳茱萸湯飲片組成及生藥濃度

Table 2 Compositions and crude herbal doses of 10 kinds of Wuzhuyu Tang

a.空白Tyrode液；b. 大棗陰性對照液；c. 生姜陰性對照液；d. 人參陰性對照液；e. 吳茱萸陰性對照液；f. 吳茱萸湯； g. 混合對照品；1. Lcs；2. Rg₁；3. Re；4. Rb₁；5. Li；6. 6-Gi；7. Ev；8. Ru；9. Rv。

圖1 外翻腸囊吸收樣品檢測專屬性HPLC圖

Fig.1 The specificity HPLC chromatograms of absorption samples in everted intestinal sacs

2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備及線性關(guān)系考察 取各對照品，先以甲醇配制成不同濃度的混合對照品溶液，取混合對照品溶液100 μL，加入Tyrode緩沖液100 μL，渦旋混勻30 s后，氮?dú)獯蹈桑蛹状?00 μL，超聲30 min復(fù)溶，3 000 r·min^-1離心5 min，取上清液，用0.45 μm針頭濾器濾過，進(jìn)樣20 μL。線性關(guān)系考察結(jié)果見表3。

表3 吸收樣品中8種成分的線性關(guān)系考察

Table 3 The linearity of calibration curves of 8 ingredients in absorption samples

2.3.4 準(zhǔn)確度試驗(yàn) 分別取高、中、低不同濃度的混合對照品溶液，按照2.3.3進(jìn)行處理，各濃度每批測定5個(gè)樣品，每個(gè)樣品測定1次，代入隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算濃度，按公式RE=（MA-1）（M為5次測定平均值，A為理論值）計(jì)算相對誤差。結(jié)果均小于17%，符合生物樣品分析要求。

2.3.5 精密度試驗(yàn) 分別取高、中、低濃度的混合對照品溶液，按照2.3.3進(jìn)行處理，重復(fù)進(jìn)樣5次，計(jì)算日內(nèi)精密度；每一濃度連續(xù)測定5 d，計(jì)算日間精密度。日內(nèi)精密度及日間精密度RSD均小于4 %，符合生物樣品分析要求。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別取高、中、低濃度的混合對照品溶液，4 ℃存放12，24，48 h后按照2.3.3進(jìn)行處理和測定，平行操作3次，計(jì)算平均值，與零時(shí)測定值進(jìn)行比較。試驗(yàn)結(jié)果顯示不同濃度混合對照品溶液4 ℃存放12，24，48 h后3次測定平均值與零時(shí)測定值相差均在4%以內(nèi)，符合生物樣品分析要求。

2.3.7 萃取回收率試驗(yàn) 分別取高、中、低濃度的混合對照品溶液，按照2.3.3進(jìn)行處理，各濃度每批測定5個(gè)樣品，每個(gè)樣品測定1次。將3個(gè)濃度對應(yīng)的未經(jīng)處理的對照品甲醇溶液直接測定，計(jì)算萃取回收率R=A_TA_s×100%為處理過的樣品峰面積值，A_S為未經(jīng)處理的相應(yīng)濃度的樣品峰面積值）。萃取回收率在75%～115%，符合生物樣品分析要求。

2.4 吳茱萸湯中各成分含量測定

取吳茱萸湯干膏適量（約相當(dāng)于生藥量3.5 g），加入分析甲醇20 mL超聲30 min，過濾，濾液蒸干，殘?jiān)由V甲醇溶解，定容至5 mL，用0.45 μm針頭濾器過濾，進(jìn)樣 10 μL，按2.3.1中色譜條件進(jìn)行測定。

2.5 大鼠外翻腸囊模型實(shí)驗(yàn)方法

2.5.1 模型的制備與取樣 實(shí)驗(yàn)前用空白Tyrode緩沖液將10種吳茱萸湯的干膏溶解，生藥濃度見表2。按照文獻(xiàn)方法[5]，分別收集10種吳茱萸湯在空腸90 min內(nèi)及回腸120 min內(nèi)的吸收樣品。將空腸前4個(gè)時(shí)間點(diǎn)樣品混合，回腸前5個(gè)時(shí)間點(diǎn)樣品混合，最后一時(shí)間點(diǎn)樣品單獨(dú)放置，-20 ℃保存。取樣結(jié)束后，測量腸囊內(nèi)剩余藥液體積。

2.5.2 供試品溶液的制備 將-20 ℃保存樣品轉(zhuǎn)移至-80 ℃預(yù)凍后冷凍干燥，每200 μL吸收樣品加甲醇500 μL，渦旋混合30 s，超聲30 min，3 000 r·min^-1離心5 min，上清液用氮?dú)獯蹈?，?00 μL吸收樣品加甲醇100 μL，渦旋混合30 s，超聲5 min，0.45 μm濾膜過濾，吸取20 μL進(jìn)樣，采用2.3.1中色譜條件進(jìn)行分析，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算濃度。endprint

2.5.3 累積吸收量計(jì)算方法 藥物累積吸收量按Q=C₁×V₁+C₂×0.1×（V+V₂）V計(jì)算。Q為空腸90 min內(nèi)或回腸120 min內(nèi)藥物的累積吸收量，C₁為混合樣品濃度，V₁為混合樣品體積，C₂為最后一時(shí)間點(diǎn)樣品濃度，V₂為腸囊內(nèi)剩余藥液體積，V為每次取樣體積200 μL。

2.6 小鼠偏頭痛模型制備方法

2.6.1 小鼠分組與給藥方法 SPF 級ICR小鼠168只，標(biāo)準(zhǔn)屏障環(huán)境中飼養(yǎng)，飼養(yǎng)室內(nèi)恒溫（25±2） ℃，恒濕（40%～60%），給予全價(jià)營養(yǎng)顆粒飼料，自由飲水，每天照明12 h。將小鼠按體重隨機(jī)分為14組。各吳茱萸湯組采取預(yù)防加治療給藥模式，按0.02 mL·g^-1體重每日灌胃給予相應(yīng)吳茱萸湯1次，陽性藥組灌胃等劑量舒馬普坦，模型組、假手術(shù)組及正常對照組灌胃等劑量蒸餾水，共20 d。

2.6.2 模型制備及取材方法 第6天開始，按照文獻(xiàn)[6]，各給藥組小鼠按0.172 mg·kg^-1體重每日皮下注射利血平注射液1次，共8 d，假手術(shù)組和正常對照組皮下注射等劑量生理鹽水；第14 d將各給藥組小鼠用3%水合氯醛麻醉，行大腦皮層埋設(shè)自體血凝塊手術(shù)，假手術(shù)組只進(jìn)針不注射，正常對照組不做處理；第21 d，將小鼠麻醉，取心臟混合血液及全腦。

2.6.3 單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及NO含量、NOS活力的測定方法 參照文獻(xiàn)方法[7]配制勻漿液并進(jìn)行腦組織勻漿、離心及單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的測定；按照試劑盒說明書進(jìn)行腦組織及血清NO含量、NOS活力的測定。

2.7 統(tǒng)計(jì)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 19. 0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以±s差示，多組間比較采用單因素方差分析（ One-Way ANOVA），顯著性水平α=0.05，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.8 外翻腸囊成分吸收量與藥效指標(biāo)相關(guān)分析方法

將空腸及回腸各成分的累積吸收量相加得到總吸收量，利用SIMCA-P+ 12.0 Demo中的PLSR方法，將總吸收量分別與藥效指標(biāo)數(shù)據(jù)、吳茱萸湯中各成分含量進(jìn)行相關(guān)分析。軟件自動進(jìn)行主成分分析，采取手動添加因素?cái)?shù)的方式使主成分對自變量及因變量的解釋能力達(dá)到90%以上，記錄回歸系數(shù)。根據(jù)回歸系數(shù)大小辨識外翻腸囊吸收成分中影響藥效指標(biāo)的主要成分，同時(shí)分析吳茱萸湯中成分對吸收成分的影響。

3 結(jié)果

3.1 10種吳茱萸湯的含量測定

為得到成分含量有差異的10種吳茱萸，在預(yù)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上有意識地選擇不同來源的飲片進(jìn)行配伍，制備成生藥含量分別為1∶2∶3的吳茱萸湯，對所得湯劑進(jìn)行HPLC-DAD分析。結(jié)果顯示湯中9種成分能夠穩(wěn)定表達(dá)，且同時(shí)存在于飲片與外翻腸囊吸收成分中，故確定此9種成分為共有成分。采用對照品對其中的Lcs，Rg₁，Re，Rb₁，Li，6-Gi，Ev及Ru進(jìn)行定量。Rv經(jīng)HPLC-DAD及LC-MS數(shù)據(jù)確定為吳茱萸苦素，因無該成分對照品，故以峰面積進(jìn)行半定量。在外翻腸囊吸收實(shí)驗(yàn)中各腸段均加吳茱萸湯液35 mL，為了相關(guān)分析方便，將上述成分含量換算為每35 mL湯劑中的總量，見表4。

3.2 10種吳茱萸湯外翻腸囊累積吸收量測定

按照2.5.3中公式計(jì)算累積吸收量，空腸及回腸的累積吸收量相加，得總吸收量。結(jié)果顯示Lcs，Rg₁，Rb₁，Rv，Li，6-Gi在不同濃度時(shí)均可進(jìn)入腸囊；Ev在3號湯組未檢出；Re在10號湯組未檢出；Ru僅在1號湯組及2號湯組檢出，見表5。

表4 10種吳茱萸湯中9種成分含量或峰面積

Table 4 Contents or pick areas of 9 ingredients in 10 kinds of Wuzhuyu Tangg·35 L^-1

注：Rv經(jīng)HPLC-DAD，LC-MS確定為吳茱萸苦素，因無對照品，以峰面積進(jìn)行半定量（表5同）。

表5 10種吳茱萸湯中9種成分的外翻腸囊總吸收量（±s，n=6）

Table 5 Total absorption quantities of 9 ingredients in 10 kinds of Wuzhuyu Tang（±s，n=6）μg

3.3 單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及NO，NOS的測定

與正常對照組及假手術(shù)相比，模型組小鼠3種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量均顯著降低，腦組織NO含量及NOS活力顯著升高，血清NO含量有所降低。給予不同吳茱萸湯治療后，多組小鼠5-HT，NE及血清NO含量顯著升高，腦NO含量及NOS活力顯著降低，與模型組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而對DA作用不明顯，見表6。

3.4 相關(guān)分析結(jié)果

3.4.1 各藥效指標(biāo)與外翻腸囊累積吸收量的偏最小二乘回歸 系數(shù)為正表示累積吸收量與藥效指標(biāo)數(shù)值呈正相關(guān)關(guān)系，負(fù)數(shù)反之。將該結(jié)果與偏頭痛指標(biāo)改善的實(shí)際情況相結(jié)合：在5-HT，NE，DA及血清NO含量中回歸系數(shù)為正表示對偏頭痛改善具有正向作用，為負(fù)表示具有負(fù)向作用；在腦組織NO含量及血清與腦組織NOS活力中與前述相反。可見在各藥效指標(biāo)中，回歸系數(shù)絕對值較大（前3位）的成分主要包括Lcs，Rg₁，Rb₁，Rv，Li，Ev，Ru 7種成分，見表7。

表6 小鼠單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量、NO含量及NOS活力（±s，n=12）endprint

Table 6 Contents and activities of monoamine neurotransmitters and NO and NOS in mice（±s，n=12）

注：與正常對照組比較^1）P<0.01；與假手術(shù)組比較^2）P<0.01；與模型組比較^3）P<0.05，^4）P<0.01。

表7 藥效指標(biāo)與外翻腸囊總吸收量的偏最小二乘回歸分析結(jié)果

Table 7 Result of PLSR analysis between the values of pharmacodynamic indexes and total absorption quantities

注：^1）表示該成分對相應(yīng)指標(biāo)影響正向作用排前3位，^2）表示該成分對相應(yīng)指標(biāo)影響負(fù)向作用排前3位。

3.4.2 吳茱萸湯中成分與外翻腸囊累積吸收量的偏最小二乘回歸 結(jié)果見表8。結(jié)果中系數(shù)為正表示吳茱萸湯中成分含量越高外翻腸囊總吸收量越大，負(fù)數(shù)反之。

4 討論

4.1 主要藥效成分的藥理作用

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Lcs，Rg₁，Rb₁，Rv，Li，Ev，Ru與藥效指標(biāo)回歸系數(shù)絕對值較大，對多種藥效指標(biāo)具有顯著的調(diào)節(jié)作用，因此可能是吸收成分中影響藥效的主要藥效成分。前人對上述成分的藥理作用進(jìn)行了深入的研究，結(jié)果表明Rg₁能夠保護(hù)DA能神經(jīng)元[8]，并能提高心肌組織NO水平，促進(jìn)心肌血管再生[9]。Rb₁能與中樞單胺能神經(jīng)相互作用，升高5-HT等神經(jīng)遞質(zhì)含量[10]，同時(shí)可通過下調(diào)NO含量發(fā)揮抗氧化應(yīng)激的作用[11]。Li具有顯著的神經(jīng)保護(hù)作用[12]，能夠抑制鈣內(nèi)流及NO的過度生成[13]，但是否能夠升高5-HT含量未見報(bào)道。Ev可促進(jìn)兒茶酚胺類物質(zhì)的分泌[14]，劑量依賴的抑制單胺氧化酶活性[15]，通過上述2種作用增加模型小鼠腦內(nèi)5-HT及NE含量；同時(shí)Ev是辣椒素受體（transient receptor potential vanilloid type 1，TRPV1）的激動劑，通過激活該受體，促進(jìn)小鼠主動脈及離體內(nèi)皮細(xì)胞的內(nèi)皮型NOS磷酸化，進(jìn)而誘導(dǎo)NO的產(chǎn)生[16]；Ru具有促進(jìn)兒茶酚胺類物質(zhì)的分泌的作用[17]。上述藥理作用可能是各成分在本實(shí)驗(yàn)中對不同藥效指標(biāo)顯示正向作用的基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示Lcs及Rv對所有指標(biāo)均有較顯著的調(diào)節(jié)作用，而目前對Lcs活性的研究尚未見報(bào)道，Rv僅見對其抗氧化活性的研究[18]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為2種成分今后的藥理研究提供了參考?？傊Y(jié)果顯示吳茱萸湯多種成分對同一指標(biāo)，同一成分對多種指標(biāo)都存在作用，提示吳茱萸湯治療作用的優(yōu)化需要對湯中有關(guān)成分含量及相互間比例進(jìn)行控制。

表8 吳茱萸湯中各成分與外翻腸囊中相應(yīng)成分總吸收量的偏最小二乘回歸分析

Table 8 Result of PLSR analysis between the contents of ingredients in Wuzhuyu Tang and its′ total absorption quantities in everted intestine sacs

4.2 外翻腸囊吸收譜效相關(guān)

外翻腸囊法是一種經(jīng)典的研究藥物吸收的體外方法，其吸收結(jié)果與體內(nèi)藥物吸收水平接近，吸收成分種類遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于湯中成分，因此與藥物譜效相關(guān)分析相比，外翻腸囊法更加注重藥物與機(jī)體的相互作用，且結(jié)果分析難度低；藥物成分在外翻腸囊中主要為累積吸收，極少受分布與代謝的影響，有效避免了血清指紋譜-效相關(guān)中需要分析指紋譜中譜峰的動力學(xué)過程與藥效作用關(guān)系的復(fù)雜工作以及對檢測條件的高要求，給譜效相關(guān)研究提供了可行的方法。前期研究已經(jīng)證實(shí)吳茱萸湯外翻腸囊吸收成分與入血成分存在較好的對應(yīng)關(guān)系，可替代入血成分分析[5，19-20]。本實(shí)驗(yàn)首次將外翻腸囊累積吸收量與藥效實(shí)驗(yàn)結(jié)果聯(lián)系起來，目的是模擬藥物體內(nèi)過程進(jìn)行吸收譜效相關(guān)，根據(jù)表7中結(jié)果（回歸系數(shù)的正負(fù)與大?。┲庇^發(fā)現(xiàn)化學(xué)成分與偏頭痛藥效指標(biāo)的關(guān)系，從而快速發(fā)現(xiàn)藥效物質(zhì)。

4.3 外翻腸囊吸收譜效相關(guān)結(jié)果的可信性驗(yàn)證

課題組曾建立了吳茱萸湯特征圖譜，在獲得了10種吳茱萸湯中成分含量后，將其與藥效進(jìn)行了譜效相關(guān)分析（即藥物譜效相關(guān)），結(jié)果發(fā)現(xiàn)Rg₁，Re，Rb₁，Rv，Li，Ev，Ru及未知物質(zhì)X含量與藥效指標(biāo)回歸系數(shù)較大，為影響藥效的主要成分，其中Rb₁，Rv，Ev，Ru是主要的正向作用成分。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示湯中未知物質(zhì)X未吸收入腸，而吸收成分中Lcs，Rg₁，Rb₁，Rv，Li，Ev，Ru與藥效指標(biāo)回歸系數(shù)較大，為影響藥效的主要成分，其中Rg₁，Rv，Ev及Ru為主要的正向作用成分。兩者比較，影響藥效的主要成分除Lcs及Re外均相同，正向作用成分4種中有三者相同。根據(jù)藥物譜效、吸收譜效的相關(guān)分析結(jié)果，結(jié)合表8湯中成分含量對吸收總量的影響，按成分含量高低檢索10種吳茱萸湯，均發(fā)現(xiàn)5號湯與8號湯各成分含量較符合篩選結(jié)果，藥效實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示此二組指標(biāo)改善作用較好，說明2種方法結(jié)果一致，本實(shí)驗(yàn)采用的外翻腸囊吸收譜效相關(guān)分析在中藥復(fù)方藥效物質(zhì)發(fā)現(xiàn)方面是可行的。

4.4 外翻腸囊吸收譜效與藥物譜效結(jié)果差異的分析

目前采用血清譜效相關(guān)和藥物譜效相關(guān)進(jìn)行單味藥及復(fù)方藥效物質(zhì)發(fā)現(xiàn)的研究已比較常見[21]，但兩者的比較研究未見報(bào)道。筆者認(rèn)為，立足于體內(nèi)過程的譜效相關(guān)分析結(jié)果應(yīng)與立足于復(fù)方本身的譜效相關(guān)分析結(jié)果進(jìn)行比較，確定一致性并找出相互關(guān)系，不僅應(yīng)明確影響藥效的主要成分（即定性），也應(yīng)明確成分含量高低對指標(biāo)改善的影響（即定量），這樣才可能有依據(jù)地控制藥物中有效成分種類及量的大小，達(dá)到優(yōu)化藥物療效的目的。具體到本研究，除對其相似性進(jìn)行了比較外，還發(fā)現(xiàn)了以下差異：①在影響藥效的主要成分中，吸收譜效中Lcs被選出，Re未被選出（表7），在藥物譜效中則相反。在主要正向作用成分中，Rg₁在吸收譜效中被選出，Rb₁未被選出，藥物譜效則相反。值得注意的是，表8結(jié)果顯示湯中成分含量越高，越有利于Lcs，Rg₁的吸收，而不利于Re，Rb₁的吸收。不同的吸收特點(diǎn)是否是造成2種方法篩選結(jié)果差異的原因（如影響回歸系數(shù)大小從而影響排序及篩選結(jié)果），有待進(jìn)一步研究。②同樣，對某些藥效指標(biāo)，同一種主要藥效成分，在吸收譜效與藥物譜效中回歸系數(shù)正負(fù)相反，如Rb₁對血清NO及NOS，Ev對5-HT，腦NOS的影響等。表8結(jié)果顯示湯中這2種成分含量越高，則累積吸收量越低，與前人研究類似[5，22]，這可能是導(dǎo)致結(jié)果相反的原因。上述結(jié)果說明，分析外翻腸囊吸收譜效相關(guān)結(jié)果時(shí)，需要考慮藥物成分濃度對自身吸收的影響，以指導(dǎo)吳茱萸湯各成分的調(diào)控，從而優(yōu)化治療作用。endprint

4.5 關(guān)于PLSR

目前譜效相關(guān)研究多采用多元線性回歸分析或多元相關(guān)分析進(jìn)行[23-24]，這些分析方法在樣本數(shù)小于等于自變量數(shù)或自變量間存在多重共線性時(shí)不適用。PLSR是譜效相關(guān)中分析方法的一種，有效解決了上述問題[25]，但尚未見用于復(fù)方藥效物質(zhì)發(fā)現(xiàn)研究的報(bào)道，本試驗(yàn)應(yīng)用結(jié)果證明可行。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 龔慕辛，王雅璕，鄒志東，等.吳茱萸湯現(xiàn)代臨床應(yīng)用證藥規(guī)律分析[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2009，15（4）：84.

[2] 寧黎麗，畢開順，王瑞，等.吳茱萸湯藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的方法學(xué)研究[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，2000，35（2）：131.

[3] 楊志欣，孟永海，王秋紅，等.吳茱萸化學(xué)拆分組分的性味藥理學(xué)評價(jià)-化學(xué)拆分組分的制備及其鎮(zhèn)痛作用的研究[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2011，39（4）：11.

[4] 王雅璕，龔慕辛，王智民，等.吳茱萸湯大孔樹脂精制工藝[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2010，16（5）：1.

[5] 龔慕辛，王雅璕，宋亞芳，等.外翻腸囊法快速發(fā)現(xiàn)吳茱萸湯吸收成分群的研究[J].中國中藥雜志，2010，35（11）：1399.

[6] 吳燕川， 潘學(xué)強(qiáng)， 龔慕辛，等.吳茱萸湯對虛寒型偏頭痛小鼠單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及一氧化氮含量的調(diào)控作用[J].中醫(yī)學(xué)報(bào)，2012，27（174）：1438.

[7] 李娜，金翠英，周建平，等.元胡止痛膠囊鎮(zhèn)痛作用及機(jī)制研究[J].中國中藥雜志，2010，35（10）：1319.

[8] Xu H M， Jiang H， Wang J， et al. Rg₁protects iron-induced neurotoxicity through antioxidant and iron regulatory proteins in 6-OHDA-treated MES23.5 cells[J]. J Cell Biochem， 2010，111（6）：1537.

[9] 張慶勇，陳燕萍，劉芬，等.人參皂苷 Rg₁對大鼠急性缺血心肌血管再生的促進(jìn)作用[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，35（1）：42.

[10] Lee S H， Hur J， Lee E H， et al. Ginsenoside Rb₁modulates level of monoamine neurotransmitters in mice frontal cortex and cerebellum in response to immobilization stress[J]. Pharmacol Therapeut， 2012，20（5）：482.

[11] Kim S， Na J Y， Song K B， et al. Protective effect of ginsenoside Rb₁on hydrogen peroxide-induced oxidative stress in rat articular chondrocytes[J]. J Ginseng Res， 2012，36（2）：161.

[12] Yoon J S， Sung S H， Kim Y C. Neuroprotective limonoids of root bark of dictamnus dasycarpus[J]. J Nat Prod， 2008，71 （2）：208.

[13] Yoon J S， Yang H， Kim S H，et al. Limonoids from dictamnus dasycarpus protect against glutamate-induced toxicity in primary cultured rat cortical cells[J]. J Mol Neurosci， 2010，42（1）：9.

[14] Zhao F R， Mao H P， Zhang H， et al. Antagonistic effects of two herbs in Zuojin wan， a traditional Chinese medicine formula， on catecholamine secretion in bovine adrenal medullary cells[J]. Phytomedicine， 2010，17（8/9）：659.

[15] Lee S S， Hwang B Y， Ro J S， et al. Inhibition of monoamine oxidase by evodiamine[J]. Saengyak Hakhoechi， 2006，37（4）：320.

[16] Ching L C， Chen C Y， Su K H， et al. Implication of AMP-activated protein kinase in transient receptor potential vanilloid type 1-mediated activation of endothelial nitric oxide synthase[J]. Mol Med， 2012，18（5）：805.

[17] Hao K， Gong P， Sun S Q， et al. Mechanism-based pharmacokinetic-pharmacodynamic modeling of the estrogen-like effect of ginsenoside Rb₁on neural 5-HT in ovariectomized mice[J]. Eur J Pharm Sci， 2011，44（1/2）：117.endprint

[18] Dolabela M F， Oliveira S G， Nascimento J M， et al. In vitro antiplasmodial activity of extract and constituents from Esenbeckia febrifuga， a plant traditionally used to treat malaria in the Brazilian Amazon[J]. Phytomedicine， 2008，15（5）：367.

[19] Gong M X， Wang Y X， Sun J， et al. Dynamic analysis of 10 components of the Chinese herbal compound Wuzhuyu-tang absorbed into rat plasma[J]. Neural Regen Res， 2011，6（33）：2594.

[20] Hu C Q， Li F， Yang X W. Simultaneous determination and pharmacokinetic analysis of seven alkaloids and two flavonoids from rat plasma by HPLC-DAD after oral administration of Wuzhuyu decoction[J]. J Asian Nat Prod Res， 2012， 14（4）：370.

[21] 郭承軍，石俊英.金銀花抗小鼠流感作用的譜效關(guān)系研究[J].中藥藥理與臨床，2009，25（4）：50.

[22] 李文蘭，南莉莉，季宇彬，等.人參中人參皂苷Rg₁，Rb₁在體腸吸收影響因素的研究[J].中國中藥雜志，2009，34（20）：2627.

[23] Xiao S， Zhang L F， Zhang X， et al. Tracing antibacterial compounds from Acalypha australis Linn. by spectrum-effect relationships and semi-preparative high-performance liquid chromatography[J]. J Sep Sci， 2013，36（9/10）：1667.

[24] 沈嵐，張梁，馮怡，等.芍藥甘草復(fù)方效應(yīng)組分譜效關(guān)系研究[J].中國中藥雜志，2008，33（22）：2658.

[25] 王惠文，吳載斌，孟潔.偏最小二乘回歸的線性與非線性方法[M].北京：國防工業(yè)出版社，2006：316.

Study on pharmacological ingredients of Wuzhuyu Tang treating

migraine by correlating absorption ingredients in everted intestinal

sac and pharmacodynamics

PAN Xue-qiang， WU Yan-chuan， GONG Mu-xin， XU Yong-song， WANG Zhi-min， ZHANG Qi-wei， SHANG Ya-wen， LU Xu-ran， SONG Ya-fang

（1.School of Traditional Chinese Medicine， Capital Medical University， Beijing 100069， China；

2.Xuanwu Hospital of Capital Medical University， Beijing 100053， China；

3. Institute of Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China；

4.Capital Medical University Yangjing Medical College， Beijng 100300， China）

[Abstract] Wuzhuyu Tang is a classical formula for treating migraine， but its′ pharmacological ingredients is unclear yet. Present study employed the everted intestinal sac model to collect the absorption samples of 10 kinds of Wuzhuyu decoction， and then analyzed the contents of 9 ingredients in Wuzhuyu Tang and absorption samples quantitatively or semi-quantitatively by HPLC-DAD method. Reserpine was used to establish the mice model of migraine， and then the contents and activities of 5-hydroxytryptamine， noradrenaline， dopamine， nitric oxide and nitricoxide synthase in brain tissues and serums were determined respectively after oral administration of Wuzhuyu Tang. Using the partial least squares regression method to correlate the total absorption quantity of 9 ingredients and pharmacodynamics. The result shows that limocitrin-3-O-β-D-glucoside， ginsenoside Rg₁and Rb₁， rutaevine， limonin， evodiamine and rutaecarpine are the main ingredients influenced the effects in absorption samples in everted intestinal sacs， especially ginsenoside Rg₁， rutaevine， evodiamine and rutaecarpine among them have obvious improving effects to most pharmacodynamics index， might be the pharmacological ingredients influenced the therapeutical effects of Wuzhuyu Tang treating migraine.

[Key words] Wuzhuyu Tang； migraine； everted intestinal sac absorption fingerprint-effect relationship； partial least squares regression； pharmacological ingredients

doi：10.4268/cjcmm20140124

[責(zé)任編輯 陳玲]endprint