IL-1、IL-6在腰椎間突出盤中的表達及臨床研究

丁國良，李秀英，呂沐昕△，李秀英

（1.內蒙古科技大學包頭醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院骨科，內蒙古包頭014030；2.內蒙古包頭市第四醫(yī)院病案室 014030）

腰椎間盤突出癥是由于間盤變性，纖維環(huán)破裂，髓核突出刺激或壓迫神經根、馬尾神經所表現(xiàn)出的以腰腿疼痛，間歇性跛行為主要癥狀的臨床綜合征。腰間盤退變是腰椎間盤突出癥的病理基礎，其中，髓核的退變最為明顯［1－2］。近10年來分子生物學和分子免疫學對細胞因子和炎癥因子研究表明在退變的間盤組織中能產生炎性介質，炎性介質已被公認為是導致間盤退變的主要因素之一，IL-1、IL-6被公認為是與間盤退變相關的最重要的炎性細胞因子之一，可刺激炎癥細胞的聚集、激活和炎癥遞質的釋放［3］。探討IL-1、IL-6在突出的間盤中的表達情況，以及他們與間盤突出程度之間的關系，對于揭示二者在間盤突出過程中所起的作用具有一定的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2012年3月至2013年9月在本院接受手術治療的腰椎間盤突出癥患者30例（觀察組）。其中，男19例，女11例；年齡25～56歲，平均（41.32±7.24）歲。病程3～10年。椎間盤節(jié)段：L3～4 2例，L4～5 17例，L5～S1 11例。結合X線片表現(xiàn)與臨床所見，按間盤突出的程度分為3組：膨出型組8例，突出型組13例，游離型組9例。2012年3月至2013年9月在本院因外傷致腰椎骨折手術的患者20例（對照組），其中，男12例，女8例，年齡27～58歲，平均（42.35±6.49）歲。椎間盤節(jié)段：L1～2有6例，有L2～3有8例，L3～4有6例。納入標準：傷前無腰椎間盤突出癥的典型臨床表現(xiàn)及椎管手術病史和相關的免疫系統(tǒng)疾??；術前檢查證實不存在與實驗相關的免疫系統(tǒng)疾病和急慢性感染病史；腰椎正側位X線片和CT掃描均未發(fā)現(xiàn)腰椎間盤突出，術中腰椎骨折處無間盤突出等肉眼所見的病理表現(xiàn)。實驗設備為德國Hermle及芬蘭Labsystems公司，IL-l、IL-6ELISA 試劑盒購自美國 Endogen公司，其余試劑均為進口分裝。

1.2 方法 實驗組患者全身麻醉后經腰椎后路實行髓核摘除術，根據(jù)術中表現(xiàn)，對突出椎間盤按以下類型分別處理：（1）膨出型，取突入椎管與神經根接觸部分；（2）突出型，取突破纖維環(huán)、后縱韌帶與神經根接觸部分及肉眼分辨存在退變部分；（3）游離型，取游離到椎管內部分及肉眼分辨明顯存在退變部分。術中切取病變椎間盤的髓核組織為標本。對照組患者全身麻醉后經前路或后路手術，腰椎骨折患者于骨折椎體間盤部位吸取少許椎間盤的髓核組織為標本。

1.2.1 檢測方法 每位患者標本均分成兩份，第一份制成石蠟切片行HE染色、免疫組化法；第二份進行ELISA檢測。術中取出的第一份髓核組織用磷酸鹽緩沖液（PBS，0.1mol／L，pH＝7）反復沖洗凈沾染的血液等，編號后置于－20℃冰箱保存。待標本統(tǒng)一收集后風干，稱質量，超聲粉碎后每100mg組織加1.00mL PBS，冰浴下以玻璃勻漿器手動勻漿，以5 000r／min的速率離心30min，取上清液進行實驗測定。第二份標本采用ELISA法檢測，檢測方法如下：（1）包被，用包被液稀釋包被用HBsAg至所需要量，每孔加0.10mL，置于4℃24h，用蒸餾水洗1次，每次均需要注滿各孔；（2）封閉，用封閉液封閉，每孔加0.20mL；（3）加樣，每塊板均設陽性對照、陰性對照和空白對照50.00mL，加入酶標抗體，混勻后，蓋封板紙；（4）孵育，置于37℃30min；（5）洗滌，用洗滌液洗5次；（6）顯色，每孔加底物0.1mL，37℃，10min；（7）終止，每孔加2mol／L硫酸0.05mL終止反應。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以±s表示，臨床資料符合正態(tài)分布，則采用配對檢驗；若臨床資料不符合正態(tài)分布，則采用非參數(shù)檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 免疫組織化學結果 鏡下可見IL-1及IL-6表達陽性細胞在突出腰椎間盤周圍的炎性肉芽組織中表達最強，見圖1、2。

圖1 IL-1的表達情況

圖2 IL-6的表達情況

觀察組中，30例患者共有19例腰間盤組織中IL-1陽性表達，陽性率為63.33%。其中，膨出型組中陽性表達3例，突出組中陽性表達8例，游離組中陽性表達8例。對照組中20例患者1例陽性表達，陽性率為5.00%。觀察組與對照組IL－1陽性率比較，差異有統(tǒng)計學意義（χ2＝15.41，P＜0.01）。游離組與膨出組IL-1陽性率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖3。

圖3 IL-1在不同類型腰椎間盤組織中的表達

觀察組中，30例突出腰椎間盤組織中IL-6表達陽性有16例，陽性率53.33%。其中，膨出型陽性表達2例，突出型陽性表達7例，游離型7例。對照組中20例患者無陽性表達細胞。觀察組與對照組IL-6陽性率比較，差異有統(tǒng)計學意義（χ2＝15.68，P＜0.01）。游離型與膨出型IL-6陽性率比較，表達差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖4。

圖4 IL-6在不同類型腰椎間盤組織中的表達

2.2 ELISA法檢測結果 兩組髓核中IL-1、IL-6水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見表1。對不同類型髓核中IL-1水平進行比較，突出型與膨出型比較，t＝11.10，P＜0.01；游離型與膨出型比較，t＝12.84，P＜0.01；游離型與突出型比較，t＝4.44，P＜0.01，對不同類型髓核中IL-6水平進行比較，突出型與膨出型比較，t＝4.57，P＜0.01；游離型與膨出型比較，t＝11.96，P＜0.01；游離型與突出型比較，t＝9.26，P＜0.01，見表2。

表1 兩組髓核中IL-1、IL-6水平比較（±s，pg／mL）

表1 兩組髓核中IL-1、IL-6水平比較（±s，pg／mL）

組別 n IL-1 IL-6觀察組30 13.93±1.09 32.26±9.63對照組20 3.12±0.23 5.30±1.87

表2 不同突出類型髓核中IL-1水平比較（±s，pg／mL）

表2 不同突出類型髓核中IL-1水平比較（±s，pg／mL）

＊：P＜0.01，與膨出型比較；△：P＜0.01，與突出型比較。

類型 n IL-1 IL-6膨出型8 9.27±0.68 11.36±3.25突出型 13 14.31±1.16＊ 24.42±7.61＊游離型 9 16.86±1.54＊△ 62.16±11.58＊△

3 討 論

3.1 間盤突出致痛的機制 目前，大多數(shù)學者認為，椎間盤源性下腰痛產生的機制有3種：（1）機械壓迫。突出的椎間盤對神經根產生壓迫，使其靜脈回流受阻，毛細血管血流減少，影響神經根的營養(yǎng)，進一步增加水腫，從而增加了神經根對疼痛的敏感性。（2）炎性反應。在手術中?？砂l(fā)現(xiàn)神經根炎性充血水腫。原因在于破裂的椎間盤會釋放出許多化學刺激性物質，導致受累的神經根或脊神經節(jié)發(fā)生炎性反應。此時神經根對疼痛敏感度增加，即使沒有突出髓核的直接壓迫，也會出現(xiàn)腰腿痛的癥狀。（3）神經體液。椎間盤纖維環(huán)、后縱韌帶、關節(jié)囊部位富含神經肽。損傷時神經肽類物質釋放，可直接刺激周圍的感受器引發(fā)疼痛［4］。

3.2 炎性因子 炎癥因子是由細胞、體液產生的參與炎性反應的一類物質，研究發(fā)現(xiàn)炎性細胞因子在椎間盤退變（IVDD）中可能發(fā)揮著重要的作用，主要包括椎間盤基質的合成與分解、炎性反應和椎間盤細胞凋亡等方面的作用［5］?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)IL、腫瘤壞死因子α（TNF-α）和集落刺激因子（CSF）等炎性細胞因子。其中，IL家族是一類重要的炎性因子，而IL-1、IL-6被公認為是與椎間盤退行性變相關的最重要炎性因子［6－7］。

3.2.1 IL-1 IL-1在椎間盤退變過程中的作用是多環(huán)節(jié)的，IL-1因子的主要作用是控制促炎性反應對組織的損傷，可通過病原體相關分子模式或者危害相關分子模式使受損害的細胞釋放出來。國外學者研究表明，IL-1在軟骨基質中的新陳代謝中起重要作用，IL-1可抑制金屬蛋白酶組織抑制劑的合成，并通過干擾椎間盤基質的合成而加重椎間盤的退行性變［8］。IL-1還可以刺激單核細胞分泌堿性成纖維細胞生長因子（bFGF），后者是內皮細胞和成纖維細胞的有絲分裂原，從而間接影響突出間盤組織新生血管的形成和纖維化過程［9］。IL-1本身可能是一種強有力的致痛物質。IL-1β致痛效率是IL-1α的3 000倍［10］。有研究表明，IL-1可促進磷脂 A2（PLA2）的激活，而PLA2是炎性反應的關鍵酶，可促進前列腺素、白三烯、血栓素、血小板活化因子等重要炎性介質的分泌，且PLA2通過酶解細胞膜磷脂可直接造成細胞膜損害［11］。

3.2.2 IL-6 IL-6作為重要的炎性介質，在類風濕性骨關節(jié)病及骨關節(jié)炎中發(fā)揮重要作用，它已被認為是引起關節(jié)破壞和炎癥發(fā)生的重要介質。IL-6可能通過影響椎間盤基質降解酶的抑制酶而發(fā)揮作用?；|降解酶能改變椎間盤基質內蛋白多糖、膠原和彈性蛋白等生物大分子的結構、功能、水平及類型，削弱了纖維環(huán)的保護作用，使髓核易從薄弱的纖維環(huán)處突出［12］。

本實驗研究結果顯示，觀察組中30例髓核標本IL-1和IL-6陽性率分別為63.33%和53.33%，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。ELISA法檢測觀察組IL-1和IL-6水平分別為（13.93±1.09）pg／mL、（32.26±9.63）pg／mL，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），且不同類型髓核中IL-1和IL-6水平差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；實驗結果說明突出型髓核組織中的IL-1、IL-6水平明顯升高，且IL-1、IL-6水平隨著間盤退變程度的加重逐漸升高，即表現(xiàn)為游離型大于突出型大于膨出型。

本研究成果在臨床工作中有多方面的指導意義，今后在治療腰椎間盤突出的患者時，不要片面地認為腰腿痛癥狀只來源于機械壓迫，炎性因子的刺激同樣很重要，可以在制訂治療方案時充分考慮到這一點，是否手術應綜合考慮，手術后用藥治療因想到使用抑制炎性因子分泌的藥物，長期隨訪的患者是否可以檢測血清IL-1、IL-6水平。筆者在健康體檢方面是否可以細化到細胞水平，是否可以早期篩查一些腰椎間盤突出的高危人群，以期達到預防為主，治療為輔的目的，這些都是值得考慮的問題。本實驗使筆者加深了對椎間盤疾病病理生理機制的認識，對提前干預椎間盤退變，緩解椎間盤疾病引起的神經根痛方面有著積極的意義。

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