漢族和維吾爾族結(jié)直腸癌患者K-ras基因突變情況及影響因素分析

劉 超，鄭 超，才 層，穆振諾，阿麗亞·阿不都卡德爾，瑪依努爾·艾力

結(jié)直腸癌是目前臨床常見的惡性腫瘤，在全球范圍內(nèi)每年新發(fā)病例數(shù)超過120萬，死亡人數(shù)超過60萬。據(jù)美國國立癌癥研究所統(tǒng)計，2012年美國新發(fā)結(jié)直腸癌患者為143 460人，死亡51 690人，居惡性腫瘤發(fā)病率和死亡率的第3位[1]。在我國結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率呈逐年增高的趨勢，且晚期結(jié)直腸癌發(fā)病率較高。近年來，結(jié)直腸癌發(fā)病率迅速上升，已成為我國最常見的5大惡性腫瘤之一，5年生存率為60%左右，其治療效果30年來無顯著改善[2]。結(jié)直腸癌中K-ras基因的突變比ras家族中其他基因的突變更常見。結(jié)直腸癌也是目前研究K-ras基因突變最多、臨床檢測應(yīng)用最多的腫瘤之一。K-ras基因突變的頻率在結(jié)直腸癌中為14%～50%[1-3]。K-ras基因的激活在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，對于進行結(jié)直腸癌的分子靶向治療具有重要的參考價值。在一些研究中,這種改變還被作為結(jié)直腸癌患者預(yù)后不良的1個指標[3-4]。

新疆維吾爾族與其他地區(qū)相比，除了社會文化、生活習(xí)慣存在差異外，與其他民族種族方面也存在不同的遺傳背景。K-ras基因在世界各地不同種族結(jié)直腸癌中的突變有差異，在新疆維吾爾族結(jié)直腸癌中的突變情況以及與新疆維吾爾族結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的文獻報道較少。研究表明：焦磷酸測序法檢測結(jié)直腸癌K-ras基因外顯子2第12和13密碼子突變具有敏感、準確的優(yōu)點,可用于臨床個體化治療中腫瘤基因突變檢測[5]。本研究應(yīng)用焦磷酸測序法對漢族和維吾爾族結(jié)直腸癌患者石蠟標本中K-ras基因外顯子2第12、13密碼子突變情況進行檢測，并分析K-ras基因突變的臨床病理學(xué)意義。

1 資料與方法

1.1 病例納入和排除標準

1.1.1 納入標準 (1)年齡18～80歲；(2)經(jīng)腸鏡病理診斷為結(jié)直腸癌的患者；(3)經(jīng)術(shù)后病理確診為結(jié)直腸癌的患者；(4)臨床資料齊全的患者；(5)知情同意參加本研究者。

1.1.2 排除標準 (1)年齡<18或>80歲；(2)已經(jīng)接受任何放療、化療、分子靶向藥物抗腫瘤治療的患者；(3)危重或伴有嚴重的高血壓、糖尿病、心腦血管及呼吸系統(tǒng)等疾病的患者；(4)結(jié)直腸的轉(zhuǎn)移性腫瘤患者；(5)拒絕參加本研究者。

1.2 臨床資料 收集2010年1月—2013年3月新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院結(jié)直腸癌活檢或手術(shù)切除病理標本91例為研究對象，其中漢族52例，維吾爾族39例；活檢標本5例，手術(shù)標本86例，獲取病理標本時，患者均未接受任何放化療、分子靶向藥物等治療。收集相關(guān)臨床及病理資料，兩組患者性別、年齡、吸煙史、飲酒史、腫瘤部位、大體病理類型、分化程度、分期、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移情況比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，見表1)。

1.3 方法 應(yīng)用焦磷酸測序法對漢族和維吾爾族結(jié)直腸癌患者石蠟切片標本中K-ras基因外顯子2第12、13密碼子突變情況進行檢測。

1.3.1 收取石蠟包埋組織標本 每例標本切成5 μm厚的石蠟切片8張,并確保切片含有70%以上的腫瘤組織。樣本均為室溫保存、病理診斷明確含有腫瘤組織的石蠟切片，保存時間不超過3年。

1.3.2 石蠟切片組織基因組DNA提取 試劑盒購自基因科技(上海)有限公司。根據(jù)組織大小，選取適量切片，將切片放入二甲苯中浸泡1 min；再將切片放入95%乙醇溶液中浸泡1 min。將組織刮下，放入1.5 ml離心管中。根據(jù)組織量加入30～50 μl含0.01%十二烷基磺酸鈉(SDS)裂解液和濃度為50 μg/ml的蛋白酶K(5 μl蛋白酶K/50 μl裂解液)，振蕩混勻，置56 ℃水浴中，反應(yīng)1.5～2.0 h后100 ℃處理10 min，10 000×g離心10 min。取上清液作為PCR模板。

表1 漢族與維吾爾族結(jié)直腸癌患者的臨床特征比較Table 1 Comparison of clinical characteristics of Han and Uyghur patients with colorectal cancer

注：*為u值；△缺失5例患者信息

1.3.3 引物設(shè)計 K-ras基因片段擴增所需引物由基因科技(上海)有限公司合成。上游引物：5′-biotin-TGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTG-3′(生物素標記5′端)；下游引物：5′-TCGTCC-ACAAAATGATTCTGAA-3′，產(chǎn)物長度為91 bp；測序引物：5′-GCACTCTTGCCTACG-3′。

1.3.4 PCR擴增 按照PCR擴增試劑盒〔購自基因科技(上海)有限公司〕實驗步驟進行PCR擴增，其中PCR反應(yīng)條件設(shè)置如下：37 ℃保溫5 min；95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性10 s，56 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共50個循環(huán)：最后72 ℃延伸5 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，選擇性地對PCR產(chǎn)物進行Agarose電泳分析，以驗證PCR擴增效率。

1.3.5 焦磷酸測序法 (1)采用PyroMark ID型Pyrosequencing焦磷酸測序儀(瑞典Biotage AB公司生產(chǎn))配套的單鏈純化裝置從PCR反應(yīng)液中分離單鏈DNA。(2)將測序反應(yīng)板放置于測序儀中進行測序。(3)數(shù)據(jù)分析：采用焦磷酸測序儀配套的分析軟件進行，首先進行SNP分析，對于存在雜合子的位點，需進一步進行基因頻率分析(見圖1～5)。

注：2個檢測位點的結(jié)果均顯示為G/G，表明K-ras基因為野生型，若結(jié)果均顯示為G/A、G/C、G/T，表明K-ras基因發(fā)生突變

圖1 K-ras野生型標準檢測圖譜

Figure1 K-ras gene wild-type standard test patterns

圖2 檢測樣本中的K-ras基因野生型報告

圖3 檢測樣本中的K-ras基因突變型報告(12密碼子GAT突變)

Figure3 K-ras gene mutation report of the samples(codon 12 GAT mutation)

圖4 檢測樣本中的K-ras基因突變型報告(12密碼子GTT突變)

Figure4 K-ras gene mutation report of the samples(codon 12 GTT mutation)

圖5 檢測樣本中的K-ras基因突變型報告(13密碼子GAC突變)

Figure5 K-ras gene mutation report of the samples(codon 13 GAC mutation)

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計處理，年齡不符合正態(tài)性分布采用中位數(shù)(上四分位數(shù)，下四分位數(shù))表示，組間比較采用秩和檢驗；計數(shù)資料采用χ2檢驗；結(jié)直腸癌患者K-ras基因突變影響因素采用多因素Logistic回歸分析法。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 兩組結(jié)直腸癌患者K-ras基因突變情況比較 K-ras基因在33例(36.3%)結(jié)直腸癌患者中為突變型，單純12密碼子突變24例(占72.7%)，單純13密碼子突變9例(占27.3%)，無12、13密碼子均突變病例。維吾爾族12密碼子突變率明顯高于漢族,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但兩組總突變率及13密碼子突變率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，見表2)。

2.2 結(jié)直腸癌患者K-ras基因突變影響因素分析 單因素分析結(jié)果顯示，不同性別、年齡、吸煙史、飲酒史、腫瘤部位、大體病理類型、分化程度、分期、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌患者K-ras基因總突變率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，見表3)。

以結(jié)直腸癌患者K-ras基因突變?yōu)橐蜃兞浚孕詣e、年齡、吸煙史、飲酒史、腫瘤部位、大體病理類型、分化程度、分期、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移為自變量(見表4)，多因素Logistic回歸法結(jié)果顯示，性別、年齡、吸煙史、飲酒史、腫瘤部位、大體病理類型、分化程度、分期、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移與結(jié)直腸癌患者K-ras 基因突變無回歸關(guān)系(P>0.05，見表5)。

表2 兩民族結(jié)直腸癌患者K-ras基因突變情況比較〔n(%)〕

Table2 Comparison of K-ras gene mutation between Han and Uyghur patients with colorectal cancer

組別例數(shù)總突變12密碼子突變13密碼子突變漢族5215(28 8) 9(17 3) 6(11 5)維吾爾族3918(46 2)15(38 5)3(7 7)χ2值2 8885 1360 370P值0 0890 0230 543

表4 結(jié)直腸癌患者K-ras基因突變影響因素的賦值

Table4 Assignment of influencing factors for K-ras gene mutation in patients with colorectal cancer

變量 賦值性別男=0，女=1年齡(歲)原始數(shù)據(jù)吸煙不吸煙=0，吸煙=1飲酒不飲酒=0，飲酒=1腫瘤部位直腸=0，結(jié)腸=1大體病理類型潰瘍型=1，隆起型=2，浸潤型=3分化程度高分化=1，中分化=2，低分化=3分期Ⅰ期=1，Ⅱ期=2，Ⅲ期=3，Ⅳ期=4浸潤深度(T)T2=1，T3=2，T4=3淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N)N0=1，N1=2，N2=3遠處轉(zhuǎn)移(M)M0=0，M1=1

3 討論

目前，結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展機制仍未完全清楚，結(jié)直腸癌的發(fā)生是一個多基因、多步驟改變的復(fù)雜過程，涉及癌基因、抑癌基因和錯配修復(fù)基因以及一些修飾基因。與結(jié)直腸癌有關(guān)的癌基因主要為ras基因和c-myc基因，其中K-ras基因突變與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，且與抗表皮生長因子受體表達及靶向藥物治療相關(guān)。K-ras是ras原癌基因家族(包括K-ras、N-ras、H-ras)重要成員之一，與腫瘤的生成、增殖、遷移、擴散以及血管生成均有關(guān)系，對人類結(jié)直腸癌影響最大，K-ras基因分為突變型和野生型，常見突變位點為K-ras基因外顯子2第12、13密碼子上，外顯子3第61密碼子。世界各地不同區(qū)域、不同種族結(jié)直腸癌的突變有差異，美國的試驗報道K-ras基因的突變率為30%～50%[6]，歐洲的K-ras基因突變率為45%～48%[7-9]，泰國、印度、韓國、日本的K-ras基因突變率為23.0%～35.4%[10-14]。我國K-ras基因突變率(14.3%～33.57%)較歐美國家的檢出率偏低，與東亞國家的相近[15-21]。

表3 結(jié)直腸癌患者K-ras基因突變影響因素的單因素分析

Table3 Univariate analysis on risk factors for K-ras gene mutation in patients with colorectal cancer

變量例數(shù)總突變〔n(%)〕χ2值P值性別2 3020 129 男5423(42 6) 女3710(27 0)年齡(歲)0 5990 439 <604916(32 7) ≥604217(40 5)吸煙史1 2920 256 無6722(32 8) 有2411(45 8)飲酒史2 0930 148 無7123(32 4) 有2010(50 0)腫瘤部位0 0100 920 結(jié)腸4918(36 7) 直腸4215(35 7)大體病理類型?0 2700 847 潰瘍型5019(38 0) 隆起型3212(37 5) 浸潤型41(25 0)分化程度?5 5640 062 高分化111(9 1) 中分化5022(44 0) 低分化259(36 0)分期?3 8770 275 Ⅰ期157(46 7) Ⅱ期219(42 9) Ⅲ期3714(37 8) Ⅳ期132(15 4)浸潤深度(T)?1 3510 509 T2208(40 0) T33816(42 1) T4288(28 6)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N)?0 6530 721 N04117(41 5) N12910(34 5) N2165(31 3)遠處轉(zhuǎn)移(M)?2 8670 090 M07029(41 4) M1163(18 8)

注：*缺失5例患者信息

本研究中K-ras基因總突變率為36.3%，單純12密碼子突變占72.7%，單純13密碼子突變占27.3%，與大部分研究結(jié)果相似[6，10，13-21]。兩民族K-ras基因總突變率分別為維吾爾族46.2%、漢族28.8%，維吾爾族12密碼子突變率(38.5%)高于漢族(17.3%)，但兩民族之間總突變率及13密碼子突變率無差異，漢族K-ras基因突變率接近東亞國家，維吾爾族K-ras基因突變率接近歐洲國家，但付大鵬等[22]研究144例直腸癌患者中漢族與維吾爾族突變率分別為20.41%(20/98)和26.09%(12/46)，本研究結(jié)果與付大鵬等研究維吾爾族基因突變率不同可能與樣本來源及樣本量有關(guān)。本研究中K-ras基因突變率與性別、年齡、吸煙史、飲酒史、腫瘤部位、大體病理類型、分化程度均無相關(guān)性，與國內(nèi)外大部分報道相似[17]，但劉偉等[16]研究中K-ras基因突變率在≥60歲的女性人群中較高，吳偉等[18]研究顯示12、13密碼子突變在原發(fā)部位、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移上有差異。本研究中K-ras基因突變率與分期、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移無相關(guān)性，國內(nèi)外大部分報道認為K-ras基因突變率與分期無關(guān)，吳文輝等[20]研究認為其與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝臟轉(zhuǎn)移及TNM分期有相關(guān)性。

表5 結(jié)直腸癌患者K-ras基因突變影響因素的多因素Logistic回歸分析

Table5 Multivariate Logistic regression analysis on risk factors for K-ras gene mutation in patients with colorectal cancer

變量βSEWaldχ2值dfP值OR值95%CI性別-0 7460 6001 54310 2140 474(0 146， 1 539)年齡-0 0280 0380 55310 4570 972(0 902， 1 048)吸煙-0 9651 4350 45210 5010 381(0 023， 6 340)飲酒1 8601 6481 27410 2596 426(0 254，162 482)腫瘤部位0 0160 5720 00110 9781 016(0 331， 3 116)大體病理類型 潰瘍型-0 0191 3570 00010 9890 981(0 902， 1 048) 隆起型-0 4271 3970 09310 7600 653(0 125， 3 022)分化程度 高分化3 0121 3365 08110 02420 328(1 481，278 915) 中分化0 5850 6990 70210 4021 796(0 457， 7 062)分期 Ⅰ期-1 6622 5590 42210 5160 190(0 001，28 563) Ⅱ期-1 2942 2560 32910 5660 274(0 003，22 843) Ⅲ期-0 5521 8020 09410 7590 576(0 017，19 675)浸潤深度(T) T2-0 6621 4270 21510 6430 516(0 031， 8 456) T3-0 6680 6261 13910 2860 513(0 150， 1 748)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N) N00 1341 3960 00910 9231 144(0 074，17 649) N1-0 7420 8660 73310 3920 476(0 087， 2 601)遠處轉(zhuǎn)移(M)-0 8761 4880 34710 5560 416(0 023， 7 692)

K-ras野生型是分子靶向治療聯(lián)合化療療效良好的預(yù)測指標，在靶向治療前明確患者的K-ras基因狀態(tài)有助于選擇合適的患者,獲得最佳療效[23-25]。大量研究表明K-ras基因編碼區(qū)的外顯子2第12、13密碼子的突變預(yù)示了對于靶向表皮生長因子受體(EGFR)的抗體治療耐藥[25-26]。因此美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(NCCN)專家組在2013年最新指南強烈推薦所有結(jié)直腸癌患者在被診斷為Ⅳ期轉(zhuǎn)移性時都應(yīng)行腫瘤組織(原發(fā)腫瘤或轉(zhuǎn)移病灶)的基因分析，早期確定K-ras基因狀態(tài)可為后續(xù)治療方案的選擇做計劃。

本研究中結(jié)直腸癌患者K-ras基因突變率維吾爾族為46.2%、漢族為28.8%，維吾爾族12密碼子突變率高于漢族。K-ras突變率與性別、年齡、吸煙史、飲酒史、腫瘤部位、大體病理類型、分化程度、分期、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移無相關(guān)性。關(guān)于本研究K-ras基因突變與其他研究臨床病理特征關(guān)系的報道不一,可能與檢測方法、樣本來源及樣本量大小不同等原因有關(guān),兩民族突變率差別仍需大量的臨床研究來進一步證實。

1 Hyodo I,Suzuki H,Takahashi K,et al.Present status and perspectives of colorectal cancer in Asia：Colorectal Cancer Working Group report in the 30th Asia-Pacific Cancer Conference[J].Jpn J Clin Oncol,2010,40(Suppl 1):38-43.

2 王琳,陳映霞,楊寧蓉,等.國人結(jié)直腸癌K-ras基因突變狀態(tài)及其對抗EGFR單抗聯(lián)合化療的反應(yīng)[J].腫瘤研究與臨床,2010,22(7):458-460.

3 管莎莎,戴廣海.K-ras基因突變對Ⅲ期大腸癌術(shù)后輔助化療療效的預(yù)測意義[J].軍醫(yī)進修學(xué)院學(xué)報,2012,33(3):211-214,218.

4 葛飛嬌,劉建芝,李珊珊,等.K-ras基因型與轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者的療效及預(yù)后的關(guān)系[J].中華腫瘤雜志,2013,35(4):273-276.

5 謝國化,姚曉虹,吳萍,等.焦磷酸測序法檢測結(jié)直腸癌患者K-ras基因外顯子2第12和13密碼子點突變[J].中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志,2012,35(7):585-592.

6 Selcukbiricik F,Erdamar S,Ozkurt CU,et al.The role of K-RAS and B-RAF mutations as biomarkers in metastatic colorectal cancer[J].J BUON,2013,18(1):116-123.

7 Al-Allawi NA,Ismaeel AT,Ahmed NY,et al.The frequency and spectrum of K-ras mutations among Iraqi patients with sporadic colorectal carcinoma[J].Indian J Cancer,2012,49(1):163-168.

8 Segal G,Liebermann N,Klang S,et al.Identification of K-RAS mutations in colorectal cancer patients in Israel[J].Harefuah,2011,150(5):447-450,491.

9 周建紅,李桂生,李高峰,等.伊立替康聯(lián)合雷替曲塞在晚期結(jié)直腸癌二線化療中的療效及安全性研究[J].中國全科醫(yī)學(xué),2013,16(2):555-557.

10 Chaiyapan W,Duangpakdee P,Boonpipattanapong T,et al.Somatic mutations of K-ras and BRAF in Thai colorectal cancer and their prognostic value[J].Asian Pac J Cancer Prev,2013,14(1):329-332.

11 Malhotra P,Anwar M,Nanda N,et al.Alterations in K-ras,APC and p53-multiple genetic pathway in colorectal cancer among Indians[J].Tumour Biol,2013,34(3):1901-1911.

12 Lee WS,Baek JH,Lee JN,et al.Mutations in K-ras and epidermal growth factor receptor expression in Korean patients with stages Ⅲ and Ⅳ colorectal cancer[J].Int J Surg Pathol,2011,19(2):145-151.

13 Kinoshita H,Yanagisawa A,Watanabe T,et al.Increase in the frequency of K-ras codon 12 point mutation in colorectal carcinoma in elderly males in Japan:the 1990s compared with the 1960s[J].Cancer Sci,2005,96(4):218-220.

14 Tai CJ,Chang CC,Jiang MC,et al.Clinical-pathological correlation of K-Ras mutation and ERK phosphorylation in colorectal cancer[J].Pol J Pathol,2012,63(2):93-100.

15 朱曉麗,蔡旭,張玲,等.中國結(jié)直腸癌患者中KRAS與BRAF基因突變特征及其臨床病理相關(guān)性[J].中華病理學(xué)雜志,2012,41(9):584-589.

16 劉偉,王麗,余英豪,等.K-ras基因在中國結(jié)直腸癌患者中的突變狀態(tài)[J].世界華人消化雜志,2011,19(13):1367-1374.

17 張文娟,楊桂芳,楊赤兵，等.直腸癌患者中K-ras基因12位點突變及p21蛋白表達的研究[J].臨床外科雜志,2010,18(12):826-828.

18 吳偉,胡錦林,鞠海星,等.散發(fā)性大腸癌K-ras基因點突變研究及其臨床病理意義[J].醫(yī)學(xué)研究雜志,2010,39(12):53-57.

19 徐向明,張國良,李敏偉,等.結(jié)直腸癌組織中K-ras基因的檢測及其意義[J].中華醫(yī)學(xué)雜志,2010,90(18):1268-1271.

20 吳文輝，肖隆斌，湯友珍，等.K-ras基因突變與結(jié)直腸癌生物學(xué)行為的關(guān)系[J].中國病理生理雜志,2009,25(11):2159-2162.

21 Van Cutsem E,Kihne CH,Hitre E,et al.Cetuximab and chemotherapy as initial treatment for metastatic colorectal cancer[J].N Engl J Med,2009,360(14):1408-1417.

22 付大鵬,龔旭晨,孔長青.維吾爾族和漢族直腸癌患者K-ras 基因第12、13 位密碼子突變情況的研究[J].中國普外基礎(chǔ)與臨床雜志,2013,20(2):165-168.

23 Salazar R,Roepman P,Capella G,et al.Gene expression signature to improve prognosis prediction of stage Ⅱ and Ⅲ colorectal cancer[J].J Clin Oncol,2011,29(1):17-24.

24 王建飛,韓曉紅,石遠凱.kras基因突變檢測對結(jié)直腸癌靶向治療的臨床指導(dǎo)意義[J].中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志,2012,35(3):286-288,291.

25 張彤,馬曉,張蕊.替吉奧治療老年或功能狀態(tài)評分差晚期結(jié)直腸癌患者的療效觀察[J].中國全科醫(yī)學(xué),2013,16(1):305-307.

26 徐晨,劉亞嵐,黃潔，等.結(jié)直腸腺癌KRAS基因突變的檢測及其臨床意義[J].中華病理學(xué)雜志,2012,41(10):667-670.