直接擴增技術(shù)在接觸性檢材DNA檢驗中的應(yīng)用

李長征 劉海東 崔 文 尋超群 孫賢學(xué) 姜銘章

(1濟寧市公安局刑偵支隊,山東 濟寧 272000；2濟寧醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)與檢驗醫(yī)學(xué)學(xué)院，濟寧 272067)

案件現(xiàn)場接觸性檢材DNA的檢驗一直是難題，傳統(tǒng)的DNA提取方法無論是chelex-100提取法、磁珠法還是硅珠法對目標(biāo)載體的選擇都為大載體，雖然可以保證獲取到足夠的DNA模板，但大體系的提取方法也降低了目標(biāo)DNA的單位濃度，從而造成擴增結(jié)果的失敗。極微量的接觸性DNA檢材如果選取大載體進行提取更容易獲得混合DNA分型。直接擴增技術(shù)是使擴增直接從檢材開始，對接觸性DNA檢材的檢驗較傳統(tǒng)提取方法有著明顯優(yōu)勢[1]，其對目標(biāo)載體的選擇更有針對性，在保證獲得足夠模板DNA的同時，更容易得到單一個體來源的DNA分型。本文采用DNA直接擴增技術(shù)對案件現(xiàn)場中的不同生物檢材DNA進行直接擴增，以探討該技術(shù)的有效性，為保證結(jié)果的可靠性和可重復(fù)性，我們采取了在載體的一定面積內(nèi)選取多個點進行平行擴增的方法。

1 材料與方法

1.1 檢材

120份檢材全部來自本實驗室日常受理案件中的現(xiàn)場生物檢材。包括手套20只，煙蒂20枚，上衣20件，飲料瓶、吸管20個，殘缺指紋40枚。分別剪取3處2mm×2mm手套拇指虎口或手背浮出的纖維、3處2mm×2mm煙蒂與口唇接觸處外面紙片、3處3mm×3mm上衣袖口或衣領(lǐng)處5cm×5cm面積內(nèi)布片、3處2mm×2mm擦拭飲料瓶口和吸管的擦拭棉簽、3處大小為2mm×2mm殘缺指紋擦拭濕棉簽。

1.2 儀器與試劑

ABI 9700 PCR儀和ABI 3500xL測序儀(美國ABI公司)；Identifiler Direct試劑盒(美國ABI公司)； Identifiler擴增試劑盒(美國ABI公司)；5% chelex-100飽和溶液；10mg/ml，蛋白酶K(proteinose K,PK)；QIAGEN硅膜試劑盒。

1.3 PCR擴增及產(chǎn)物檢測

將上述樣品采用Identifiler Direct PCR試劑盒進行直接擴增，操作按試劑盒說明進行，擴增體系12.5μl。將擴增產(chǎn)物在ABI 3500xL遺傳分析儀上進行電泳，電泳結(jié)果采用GeneMapper ID-X基因分析軟件分析。

另取上述相同樣品，分別采用QIAGEN硅膜和chelex-100提取法提取DNA，采用Identifiler試劑盒進行擴增，操作按推薦參數(shù)進行，擴增體系10μl。電泳及分析方法與上述相同。

2 結(jié)果

2.1 直接擴增法與QIAGEN硅膜和chelex-100提取法比較

50份檢材分別采用直接擴增、chelex-100法和QIAGEN硅膜法提取DNA后擴增并進行分型檢驗，以15個STR基因座及Amelogenin全部檢出為檢驗成功，檢出9個以上的STR基因座及Amelogenin為有效。

檢驗結(jié)果顯示，同一檢材用3種方法檢測，分型結(jié)果并不相同，如在手套檢材的檢測中，直接擴增法檢出的基因型均為單一個體來源，而QIAGEN硅膜及chelex-100法提取到2個獲取混合型。因此從圖1-3可以看出，相對于常規(guī)提取方法，直接擴增發(fā)更易于獲得單一個體來源的DNA分型，其檢驗結(jié)果具有更高的有效性。見圖1～3。

圖1 直接擴增法檢測手套DNA分型圖譜

圖2 QIAGEN硅膜提取手套檢材DNA分型圖譜

圖3 chelex-100法提取手套檢材DNA分型圖譜

2.2 各種生物檢材成功率

直接擴增法對手套檢材的成功率為90%，對煙蒂、衣服、飲料瓶和吸管、殘缺指紋的成功率分別為100%、70%、90%和60%，平均成功率達到70%以上。而相應(yīng)檢材QIAGEN硅膜成功率分別為50%、80%、60%、70%，30%；chelex-100成功率為50%、70%、40%、60%，10%。從表1中可以看出，直接擴增技術(shù)對不同接觸性生物檢材DNA檢驗成功率也高于常規(guī)提取方法。見表1。

表1 各種檢材的檢驗成功率(n，%)

2.3 直接擴增法平行檢驗檢材接觸性DNA的可重復(fù)性

對5種檢材一定面積內(nèi)多處取點，采用直接擴增法平行擴增，結(jié)果表明，雖然不同類別的接觸性生物檢材在成功率上略有不同，但有效分型的結(jié)果相同，說明檢材不同位置取點均可保證實驗結(jié)果的可靠性和可重復(fù)性。每個檢材不同部位檢出有效率基本相同，其成功率可能與DNA在各個取點上存在的量有差異有關(guān)。除1例手套檢材的3個點位出現(xiàn)了2種不同分型外(可能與日常生活中混戴手套有關(guān))，其余檢材的多部位取點擴增結(jié)果均為同一分型。見表2。

表2 直接擴增法平行擴增各種檢材結(jié)果(n，%)

3 討論

直接擴增試劑盒自研發(fā)投入實驗室應(yīng)用以來，一直用于違法人員數(shù)據(jù)庫的建設(shè)。檢材均為單一個體來源，F(xiàn)TA卡或濾紙?zhí)崛?，檢驗中省略了提取過程，大大節(jié)省了建庫的成本，提高了檢驗效率。一直以來，由于受到常規(guī)DNA檢驗觀念的影響，認(rèn)為這種免提取的直接擴增試劑盒只能應(yīng)用于FTA卡提取的血液檢材，而未將其作用進一步的開發(fā)。本實驗室在日常檢案中，最先將直接擴增試劑盒和直接擴增方法應(yīng)用到除血卡、血濾紙以外的其他單一個體來源的DNA檢材，如口腔拭子、毛發(fā)、肋軟骨、肌肉組織等，發(fā)現(xiàn)效果十分理想。這一應(yīng)用在很大程度上解決了提取過程中繁瑣的操作步驟，大大減輕了工作的強度。

本文中將直接擴增試劑盒應(yīng)用到案件現(xiàn)場接觸性檢材的DNA分析，發(fā)現(xiàn)直接擴增法檢驗接觸性DNA成功率明顯高于QIAGEN硅膜和chelex-100法。其主要原因是由于直接擴增法對剪取的適量接觸性檢材不需要再加入其它試劑即可直接擴增，單位體系DNA濃度較高；而采用常規(guī)QIAGEN硅膜、chelex-100法提取DNA，在提取環(huán)節(jié)中加入的各種提取試劑使本來就微量的檢材DNA被進一步被稀釋，降低了DNA模板濃度。對于常量DNA檢材不影響檢驗結(jié)果，而對于接觸性微量檢材，稀釋環(huán)節(jié)就有可能使DNA模板濃度達不到檢出的閾值，從而降低了檢出率[2]。

本文結(jié)果顯示，直接擴增法相對于QIAGEN硅膜和chelex-100法提取法更易于獲得單一個體來源的DNA分型，使檢驗結(jié)果具有更高的有效性。分析原因為直接擴增法剪取檢材面積較小，有利于獲得單一個體的脫落細胞； QIAGEN硅膜和chelex-100提取法，由于需要檢材量較大，大面積的取材則較容易提取到多人遺留的脫落細胞。

本文將案件現(xiàn)場接觸性檢材采用一定面積內(nèi)多處取點進行平行擴增，可以保證實驗結(jié)果的可靠性和可重復(fù)性。對檢材進行小面積的取點，更容易獲得單一的DNA分型，同時也容易“取不到”目標(biāo)DNA，或者恰好取到“無關(guān)DNA”，造成結(jié)果的失敗或偏差。多處取點，平行擴增可以有效地保證結(jié)果的可靠性和可重復(fù)性，從而取得較高的成功率。

綜上所述，將直接擴增技術(shù)應(yīng)用到現(xiàn)場案件不同接觸性生物檢材，創(chuàng)新了一套針對接觸性DNA檢材的直擴方法，多點取材、平行擴增、分類提取等直接擴增技術(shù)，為疑難生物檢材的檢驗應(yīng)用提供了可靠的解決方案。

[1] 張艷霞，李愛強，趙麗.直接擴增法用于現(xiàn)場檢材DNA檢驗[J].中國法醫(yī)學(xué)雜志，2012，27(1)：62-63.

[2] 李林，劉靜，王敏.直接擴增法在血痕、肋軟骨和唾液檢材中的應(yīng)用[J].中國法醫(yī)學(xué)雜志，2013，28(2)：148-149.