HIF-1α、HIF-2α和MT在人甲狀腺乳頭狀癌中的表達及其意義①

王 旎 董超然 唐 萃 楊 磊 劉智敏 (重慶醫(yī)科大學分子醫(yī)學與腫瘤研究中心，重慶400016)

HIF-1α、HIF-2α和MT在人甲狀腺乳頭狀癌中的表達及其意義①

王 旎 董超然 唐 萃 楊 磊 劉智敏 (重慶醫(yī)科大學分子醫(yī)學與腫瘤研究中心，重慶400016)

目的:探討HIF-1α、HIF-2α和MT在人甲狀腺乳頭狀癌中的表達及其意義。方法:采用免疫組化SP法檢測70例人甲狀腺乳頭狀癌組織和40例正常甲狀腺組織中HIF-1α、HIF-2α和MT的表達水平，并分析這三種蛋白表達與臨床病理指標的相關性及三者間的表達相關性。結果:在70例人甲狀腺乳頭狀癌組織中，HIF-1α、HIF-2α和MT的陽性表達率分別為52.86%(37/70)、50.00%(35/70)和 44.29%(31/70)。HIF-1α、HIF-2α 和 MT 的表達與頸部淋巴結轉移有顯著相關性(P=0.034，P=0.022，P=0.032)。此外，HIF-1α 與 HIF-2α 的表達呈顯著正相關(rs=0.258，P=0.031)，HIF-1α 與 MT 的表達呈顯著正相關(rs=0.266，P=0.026)，HIF-2α 與 MT的表達呈顯著正相關(rs=0.259，P=0.030)。兩種蛋白(HIF-1α/ HIF-2α，HIF-1α/MT，HIF-2α/MT)聯(lián)合表達較一種蛋白表達與頸部淋巴結轉移更具相關性(HIF-1α/HIF-2α:P=0.004，HIF-1α/MT:P=0.024，HIF-2α/MT:P=0.029)。HIF-1α、HIF-2α和MT三種蛋白聯(lián)合表達較兩種或一種蛋白表達與頸部淋巴結轉移更具有相關性(P=0.017)。結論:HIF-1α、HIF-2α和MT在人甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達與頸部淋巴結轉移密切相關，且三者的表達密切相關，HIF-1α、HIF-2α和MT在人甲狀腺乳頭狀癌中的表達情況可作為監(jiān)測甲狀腺乳頭狀癌頸部淋巴結轉移的指標。

甲狀腺乳頭狀癌;HIF-1α;HIF-2α;MT

低氧是實體腫瘤常見的一種微環(huán)境，并在腫瘤進展的不同階段發(fā)揮核心作用[1]。腫瘤細胞對低氧的反應主要是由低氧誘導因子1(Hypoxia inducible factor-1，HIF-1)調節(jié)的。HIF-1是由HIF-1α和HIF-1β兩個亞基構成的，其中HIF-1β是組成性表達，而HIF-1發(fā)揮作用主要是由HIF-1α亞基的活性決定的。HIF-2α與HIF-1α具有高度的同源性，它們主要激活參與細胞增殖、細胞代謝、血管生成和腫瘤轉移的基因。金屬硫蛋白(Metallothioneins，MTs)是一類富含半胱氨酸的非酶類金屬結合蛋白質家族，在細胞增殖、分化和凋亡過程中發(fā)揮著重要的作用，并且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切關系。

甲狀腺癌是內(nèi)分泌系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，占全身惡性腫瘤的1%～2%，其中甲狀腺乳頭狀癌是最常見的一種類型。目前，有關HIF-1α、HIF-2α和MT在人甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達及其與臨床病理特征的相關性研究報道甚少，本實驗通過采用免疫組化SP法檢測70例人甲狀腺乳頭狀癌標本和40例正常甲狀腺組織中 HIF-1α、HIF-2α和MT的表達情況，并結合臨床病理資料分析它們與臨床病理因素的關系及三者表達的相關性，進而探討HIF-1α、HIF-2α和MT能否作為監(jiān)測甲狀腺乳頭狀癌進展的指標。

1 材料與方法

1.1 材料 收集重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院外科2010年1月～2011年10月手術后經(jīng)病理診斷為甲狀腺乳頭狀癌的組織標本共70例和癌旁正常甲狀腺組織共40例。依據(jù)國際抗癌聯(lián)盟(UICC)分期標準:其中，Ⅰ期30例，Ⅱ期12例，Ⅲ期28例，Ⅳ期0例;23人無頸部淋巴結轉移，47人有頸部淋巴結轉移;男性14人，女性56人;患者年齡13～79歲，平均年齡41歲。腫瘤平均直徑為 2.4 cm(0.3～6.0 cm)。

1.2 主要試劑 兔抗人HIF-1α多克隆抗體為Bioworld公司產(chǎn)品。兔抗人HIF-2α多克隆抗體和鼠抗人MT單克隆抗體為Abcam公司產(chǎn)品。兔抗人IgG多克隆抗體為Millipore公司產(chǎn)品。免疫組化SP法試劑盒和DAB試劑盒均購于北京中杉金橋公司。

1.3 實驗方法 采用鏈霉親和素-過氧化物酶法(Streptavidin-Perosidase，SP)。標本均經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋及4 μm連續(xù)切片，切片分別作HE染色與免疫組化染色。石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟2 h，梯度酒精水化。熱修復后滴加3%過氧化氫，室溫30 min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次，每次5 min。10%山羊血清孵育30 min，PBS洗3次，每次5 min。滴加1∶50稀釋的兔抗人HIF-1α和兔抗人 HIF-2α多克隆抗體(Bioworld Technology，USA)和1∶100稀釋的鼠抗人MT單克隆抗體(Abcam，USA)稀釋液，于4℃過夜。室溫復溫30 min后，PBS洗3次。滴加生物素化山羊抗兔二抗和生物素化山羊抗鼠二抗，37℃孵育30 min，PBS洗3次。滴加過氧化物酶-鏈霉親和素復合物(streptavidin-HRP)，室溫孵育30 min，PBS洗3次。加入氫化二氨基聯(lián)苯胺過氧化物酶(DAB)顯色液，光學顯微鏡下控制顯色，自來水沖洗終止顯色。蘇木素復染，常規(guī)脫水，透明，中性樹膠封片。用已知陽性切片作陽性對照，用兔抗人IgG多克隆抗體替代一抗作陰性對照。

1.4 結果判定 免疫組化染色半定量評分標準包括染色強度和陽性細胞數(shù)百分比。強度分為0(未染色)、1(弱染色)、2(中度染色)和3(強染色)，陽性細胞數(shù)百分比0(＜5%陽性細胞)、1(6% ～25%陽性細胞)、2(26% ～50%陽性細胞)、3(51% ～75%陽性細胞)和4(＞75%陽性細胞)。將強度得分與陽性細胞數(shù)百分比得分相乘得到最終的染色評分:0(未染色)、+(1～4)、++(5～8)和 +++(9～12)。0或+為陰性組，++或+++為陽性組。

1.5 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理。采用χ2檢驗和Spearman等級相關分析，P＜0.05具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 HIF-1α、HIF-2α 和 MT 在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達及其與臨床病理特征的相關性 在40例正常甲狀腺組織中，HIF-1α、HIF-2α和 MT陽性表達率均為0，組織中極少量染色細胞(如圖1A、B、C)。在70例甲狀腺乳頭狀癌組織中，HIF-1α、HIF-2α和 MT陽性表達率分別為52.86%(37/70)、50.00%(35/70)和44.29%(31/70)，三者在胞漿和胞核均有表達(如圖1D、G，E、H，F(xiàn)、I)。經(jīng) Spearman等級相關分析，由表1可知，HIF-1α、HIF-2α和MT的陽性表達在甲狀腺乳頭狀癌組織和正常甲狀腺組織中具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。與此同時，HIF-1α、HIF-2α和MT的陽性表達與頸部淋巴結轉移有顯著相關性(P＜0.05)，與年齡、性別、腫瘤大小及TNM分期無顯著相關性(P＞0.05)。

圖1 HIF-1α、HIF-2α和MT在正常甲狀腺組織和甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達(SP法，×400)Fig.1 Expression of HIF-1α，HIF-2α and MT in normal thyroid tissues and papillary thyroid carcinoma tissues(SP method，×400)

表1 HIF-1α、HIF-2α和MT在甲狀腺乳頭狀癌中的表達及其與臨床病理特征的相關性Tab.1 Correlation of HIF-1α，HIF-2α and MT expression with clinicopathological characteristics in papillary thyroid carcinoma

表2 HIF-1α、HIF-2α和MT在人甲狀腺乳頭狀癌中表達的相關性Tab.2 Correlation of HIF-1α，HIF-2α and MT protein expression with one another in 129 PTCs

2.2 HIF-1α、HIF-2α 和 MT 在人甲狀腺乳頭狀癌組織中表達的相關性 經(jīng)Spearman等級相關分析，由表2可知，在70例甲狀腺乳頭狀癌組織標本中，HIF-1α與 HIF-2α蛋白表達呈顯著正相關(rs= 0.258，P=0.031)，HIF-1α 與 MT蛋白表達呈顯著正相關(rs=0.266，P=0.026)，HIF-2α 與 MT 蛋白表達呈顯著正相關(rs=0.259，P=0.030)。

2.3 人甲狀腺乳頭狀癌組織中HIF-1α、HIF-2α和MT聯(lián)合表達與頸部淋巴結轉移的相關性 由于HIF-1α、HIF-2α和MT兩兩蛋白分子間的表達具有正相關性，而統(tǒng)計分析表明，HIF-1α、HIF-2α和MT表達與頸部淋巴結轉移具有顯著相關性，我們進一步分析 HIF-1α/HIF-2α、HIF-1α/MT 和 HIF-2α/MT兩種分子同時表達與頸部淋巴結轉移是否具有統(tǒng)計學相關性。如表3所示，HIF-1α/HIF-2α兩種分子同時表達的頸部淋巴結轉移發(fā)生率(91.30%)比僅有其中一種分子表達的頸部淋巴結轉移發(fā)生率(53.85%)高，類似的結果還見于 HIF-1α/MT和HIF-2α/MT的分子表達中。HIF-1α/HIF-2α、HIF-1α/MT和HIF-2α/MT兩種分子同時表達較僅有其中一種分子表達與頸部淋巴結轉移具有更為顯著的相關性(HIF-1α/HIF-2α:P=0.004，HIF-1α/MT: P=0.024，HIF-2α/MT:P=0.029)。此外，統(tǒng)計分析表明三種分子同時表達較兩種分子或僅有其中一種分子表達與頸部淋巴結轉移具有更為顯著的相關性(P=0.017)。

表3 人甲狀腺乳頭狀癌組織中HIF-1α、HIF-2α和MT聯(lián)合表達與頸部淋巴結轉移的相關性Tab.3 Correlation of concomitant expression of HIF-1α，HIF-2α and MT with cervical lymph node metastasis

3 討論

甲狀腺乳頭狀癌約占甲狀腺惡性腫瘤的80%，其特點是生長緩慢，預后良好。然而，在某些患者中早期就表現(xiàn)出頸部淋巴結轉移或遠處轉移，這往往是導致其不良預后和死亡的主要原因。雖然頸部淋巴結轉移并不直接影響甲狀腺乳頭狀癌患者的生存率，但它會增加腫瘤局部復發(fā)率和再次手術的機會。國外研究者認為，有頸部淋巴結轉移者是無頸部淋巴結轉移者復發(fā)率和死亡率的30倍[2]。因此，甲狀腺乳頭狀癌頸部淋巴結轉移的早期診斷，對指導制定治療方案以提高臨床診治水平具有重要意義。

實體腫瘤在發(fā)生發(fā)展過程中普遍處于低氧微環(huán)境中，并對缺氧做出一系列的應激反應。腫瘤細胞在缺氧條件下，HIF-1α與HIF-2α的穩(wěn)定性增加，導致轉錄因子HIF-1與HIF-2活性增高，進而促進血管生成及腫瘤侵襲轉移相關靶基因的轉錄和翻譯[3]，促進腫瘤發(fā)生發(fā)展。MT作為HIF-1的靶基因之一，HIF-1激活可誘導MT表達上調，而MT的過表達與腫瘤細胞過度增生有關[4];另一方面，MT表達上調可增加HIF-1的穩(wěn)定性，進而增強HIF-1的轉錄活性[5]，兩者表現(xiàn)出相互促進作用。HIF-2α與HIF-1α結構相似，推測兩者也可能存在相互促進作用。研究表明，HIF-1α在卵巢癌、食管癌和頭頸部癌組織中高表達[6-8];HIF-2α在腎透明細胞癌和神經(jīng)母細胞瘤中表達上調[9，10];MT 在腎、肺、乳腺、前列腺、睪丸、卵巢、膀胱、宮頸、子宮內(nèi)膜等多種實體腫瘤中表達增加[11，12]。這三種分子在腫瘤組織中表達上調與腫瘤病人的不良預后相關[6-12]。

本研究通過檢測70例甲狀腺乳頭狀癌組織中HIF-1α、HIF-2α和MT的表達情況，三種蛋白在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達明顯高于正常甲狀腺組織(P＜0.05)。在70例甲狀腺乳頭狀癌組織中，HIF-1α、HIF-2α和MT的過表達與患者的年齡、性別、腫瘤大小及TNM分期無明顯相關性，而與頸部淋巴結轉移顯著相關(P＜0.05)。Spearman等級相關分析提示:HIF-1α與HIF-2α、HIF-1α與MT以及HIF-2α與MT的表達均呈顯著正相關(P＜0.05)，這表明HIF-1α、HIF-2α和MT在甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)展過程可能具有相互協(xié)同作用。

鑒于HIF-1α、HIF-2α和MT的表達與頸部淋巴結轉移有關，且三種蛋白兩兩間存在正相關性。本研究對HIF-1α、HIF-2α和MT兩兩陽性表達是否與頸部淋巴結轉移具有顯著相關性進行了進一步分析。結果顯示:HIF-1α與 HIF-2α、HIF-1α與 MT、HIF-2α與MT兩種蛋白同時表達較僅有其中一種分子表達與頸部淋巴結轉移具有更為顯著的相關性。三種分子同時表達較兩種分子或僅有其中一種分子表達與頸部淋巴結轉具有更為顯著的相關性。通過本實驗及相關文獻，在甲狀腺乳頭狀癌中腫瘤低氧微環(huán)境可通過激活HIF-1α與HIF-2α上調MT的表達;另一方面，MT可以增加HIF-1α與HIF-2α的穩(wěn)定性，進而增強HIF-1和HIF-2的轉錄活性，同時增強腫瘤的侵襲與轉移能力，但其分子機制有待進一步研究。

通過本次實驗，可初步認為HIF-1α、HIF-2α和MT在甲狀腺乳頭狀癌中的表達情況可作為監(jiān)測其發(fā)展的指標，聯(lián)合檢測HIF-1α、HIF-2α和MT在甲狀腺乳頭狀癌中的表達，可為臨床早期診斷發(fā)現(xiàn)頸部淋巴結轉移提供生物學指標。

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[收稿2013-10-02 修回2013-12-09]

(編輯 許四平)

Expression and significance of HIF-1α，HIF-2α and MT in human papillary thyroid carcinoma

WANG Ni，DONG Chao-Ran，TANG Cui，YANG Lei，LIU Zhi-Min.Molecular Medicine and Cancer Research Center，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China

Objective:To investigate the expression of HIF-1α，HIF-2α and MT in human papillary thyroid carcinoma(PTC) and the association of their expression with clinicopathological indicators.MethodsImmunohistochemistry was used to analyze the expression of HIF-1α，HIF-2α and MT in 70 PTC samples.The correlations of HIF-1α，HIF-2α and MT expression with one another，and with several clinicopathological indicators were statistically analyzed.ResultsIn 70 PTC samples，the positive expression rates of HIF-1α，HIF-2α and MT were 52.86%(37/70)，50.00%(35/70)and 44.29%(31/70)，respectively.HIF-1α，HIF-2α and MT expression had significant correlations with cervical lymph node metastasis(P=0.034，P=0.022，and P=0.032，respectively).Meanwhile，HIF-1α expression had a positive correlation with HIF-2α (rs=0.258，P=0.031)and MT(rs=0.266，P=0.026).HIF-2α and MT expression were positively correlated(rs=0.259，P=0.030).Concomitant expression of any two or all of the three molecules had stronger correlation with lymph node metastasis than did each alone(P=0.004 for HIF-1α/HIF-2α，P=0.024 for HIF-1α/MT，P=0.029 for HIF-2α/MT，P=0.017 for HIF-1α/HIF-2α/MT).ConclusionHIF-1α，HIF-2α and MT expression in PTC samples have a closely correlation，which are related to cervical lymph node metastasis.Therefore，the expression of HIF-1α，HIF-2α and MT might be used as biomarkers for cervical lymph node metastasis of PTC.

Papillary thyroid carcinoma;HIF-1α;HIF-2α;MT

R736.1

A

1000-484X(2014)05-0662-05

10.3969/j.issn.1000-484X.2014.05.020

①本文受國家自然科學基金面上項目(81072183)、重慶市自然科學基金重點項目(CSTC，2011BA5038)、國家留學人員科技活動啟動項目(渝人社辦，2011.235號)和重慶醫(yī)科大學重點科研課題(XBZD201002)資助。

王 旎(1987年－)，女，主要從事乳頭狀甲狀腺癌轉移機制的研究，E-mail:cqwangni@qq.com。

及指導教師:劉智敏(1962年－)，女，博士，教授，碩士生導師，主要從事甲狀腺癌方面的研究，E-mail:liuzm9999@aliyun.com。

·臨床免疫學·