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    紅霉素對(duì)香煙煙霧刺激的人巨噬細(xì)胞組蛋白去乙?;?表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究①

    2014-02-06 04:38:28李梅華鐘小寧文明智何志義彭信言廣西醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸科南寧530021
    中國(guó)免疫學(xué)雜志 2014年5期
    關(guān)鍵詞:乙酰化紅霉素香煙

    李梅華 鐘小寧 文明智 何志義 彭信言 (廣西醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸科,南寧 530021)

    紅霉素對(duì)香煙煙霧刺激的人巨噬細(xì)胞組蛋白去乙?;?表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究①

    李梅華 鐘小寧 文明智 何志義 彭信言 (廣西醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸科,南寧 530021)

    目的:探討紅霉素對(duì)香煙煙霧刺激的人巨噬細(xì)胞組蛋白去乙?;?(HDAC3)表達(dá)的影響。方法:體外培養(yǎng)人類(lèi)單核細(xì)胞系U937細(xì)胞,用佛波脂(PMA)將其誘導(dǎo)分化為人巨噬細(xì)胞。按傳統(tǒng)方法制備好香煙煙霧提取物(CSE)用于實(shí)驗(yàn)。將傳代后的細(xì)胞分組:對(duì)照組、CSE組、紅霉素+CSE組、HDAC特異性抑制劑曲古霉素(TSA)組。采用比色法檢測(cè)細(xì)胞HDAC總活性;Western blot檢測(cè)HDAC3和NF-κB蛋白表達(dá);通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)細(xì)胞上清液中TNF-α的濃度。結(jié)果:1%CSE刺激人巨噬細(xì)胞引起細(xì)胞HDAC總活性減弱和HDAC3蛋白表達(dá)下降,誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB活性增高,釋放TNF-α;紅霉素(1μg/m l)預(yù)孵育24 h可以增強(qiáng)CSE抑制的巨噬細(xì)胞HDAC3蛋白表達(dá),下調(diào)NF-κB蛋白表達(dá),抑制TNF-α的合成和釋放。結(jié)論:紅霉素通過(guò)上調(diào)HDAC3蛋白表達(dá)水平而抑制香煙煙霧誘導(dǎo)增強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄因子NF-кB活性,進(jìn)而影響炎癥介質(zhì)TNF-α的合成調(diào)控。

    紅霉素;組蛋白去乙酰化酶3;香煙煙霧

    現(xiàn)在越來(lái)越多的證據(jù)支持大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物(紅霉素、羅紅霉素、克拉霉素、阿奇霉素)作為免疫調(diào)節(jié)劑治療方案在慢性肺部疾病,包括彌漫性泛細(xì)支氣管炎、肺囊性纖維化、支氣管哮喘和慢性阻塞性肺疾病(COPD)等的應(yīng)用[1-3]。近期一些研究表明[4,5],長(zhǎng)期小劑量應(yīng)用大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)治療 COPD 取得了較好的效果。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)紅霉素可以抑制支氣管上皮細(xì)胞IL-8、細(xì)胞間黏附因子(ICAM-1)的合成和釋放,與抑制轉(zhuǎn)錄因子 NF-κB、激活蛋白-1(AP-1)活性有關(guān)[6],但有關(guān)紅霉素抑制炎癥基因轉(zhuǎn)錄活化的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑目前尚不清楚,因此我們?cè)诒緦?shí)驗(yàn)中探討紅霉素抵抗香煙煙霧所誘導(dǎo)的炎癥機(jī)制中的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑。

    1 材料與方法

    1.1 材料 佛波脂(PMA):美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品;甲天下牌香煙(焦油:15 mg,煙堿:1.1 mg):廣西南寧卷煙廠;紅霉素:美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品;IL-8酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)試劑盒:美國(guó)RD公司產(chǎn)品;DIG凝膠遷移率試劑盒:瑞士Roche公司產(chǎn)品;核蛋白提取試劑盒:美國(guó)Pierce公司產(chǎn)品;BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒:美國(guó)Pierce公司產(chǎn)品;HDAC活性測(cè)定試劑盒:美國(guó)Santa Crus公司產(chǎn)品;HDAC3多克隆抗體:美國(guó)Santa Crus公司產(chǎn)品。人類(lèi)單核細(xì)胞系細(xì)胞株(U937細(xì)胞)從中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)購(gòu)買(mǎi)。

    1.2 分組 將傳代后的人巨噬細(xì)胞分組:①對(duì)照組;②CSE組(加入1%CSE孵育24 h);③紅霉素+CSE組(1μg/ml紅霉素預(yù)孵育24 h后,加入1%CSE繼續(xù)孵育24 h);④HDAC特異性抑制劑曲古霉素(TSA)組(加入TSA 100 ng/ml孵育24 h)。

    1.3 方法

    1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞在5%CO2,37℃,以含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng),每周傳代約2次。

    1.3.2 應(yīng)用佛波脂將U937單核細(xì)胞系誘導(dǎo)分化成巨噬細(xì)胞[7]①將 U937單核細(xì)胞重懸,離心(800~1 000 r/min,30~60 s),棄上清液。②加入新的培養(yǎng)基,重懸,計(jì)數(shù)。③將細(xì)胞均勻地接種到6孔板中,每孔細(xì)胞數(shù)為0.5×107~1×107個(gè)細(xì)胞。④加入佛波脂(10 ng/ml)誘導(dǎo)24 h。⑤24 h后,細(xì)胞貼壁,并可見(jiàn)細(xì)胞伸出偽足,提示單核細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)分化成巨噬細(xì)胞,丟棄上清液,加入新的培養(yǎng)基。

    1.3.3 香煙煙霧提取物(CSE)的制作 ①參照以往CSE的制作方法及Se-Ran的香煙煙霧提取物的改良制作方法[8-10],將2支去過(guò)濾嘴香煙(甲天下牌香煙,長(zhǎng)度84 mm,焦油含量:15 mg,煙堿含量:1.1 mg)燃燒完全后所產(chǎn)生的香煙煙霧由注射器驅(qū)動(dòng)裝置連續(xù)抽吸,將煙霧緩慢通入20 m l無(wú)血清的培養(yǎng)基中,制成懸液,密封瓶?jī)?nèi),搖動(dòng)使其充分溶解,得到10%濃度的CSE溶液,其濃度計(jì)算為煤焦油含量1 500 mg/L和煙堿含量110 mg/L。②將溶液的pH值調(diào)至7.4。③用0.22μm濾膜過(guò)濾溶液。④溶液于1 h內(nèi)用于實(shí)驗(yàn),稀釋到需要的濃度后加入細(xì)胞。

    1.3.4 TNF-α檢測(cè) 按照ELISA試劑盒內(nèi)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

    1.3.5 HDAC總活性測(cè)定 ①核蛋白提取,收集:按照核蛋白提取試劑盒(Pierce公司)說(shuō)明進(jìn)行。②核蛋白濃度檢測(cè):按照Pierce公司BCA蛋白檢測(cè)試劑盒進(jìn)行。③HDAC活性測(cè)定:按照試劑盒(Santa Crus公司)實(shí)驗(yàn)說(shuō)明進(jìn)行測(cè)定。

    1.3.6 HDAC3和NF-κB蛋白表達(dá)水平測(cè)定 應(yīng)用蛋白印跡實(shí)驗(yàn)(Western blot)檢測(cè)HDAC3和NF-κB蛋白表達(dá)。4℃ 0.01 mol/L PBS單洗細(xì)胞3次,加300μl蛋白裂解液,裂解產(chǎn)物在冰上繼續(xù)裂解30 min后4℃、12 000 r/min離心10 min。取上清測(cè)蛋白濃度及調(diào)整蛋白濃度,至3μg/μl,SDS-PAGE蛋白緩沖液按照比例混合,煮沸5min,立即放入冰箱,4℃、12 000 r/min離心 10 min,取上清,分裝,放 -20℃?zhèn)溆?。制?0%SDS-PAGE膠,4℃保存過(guò)夜,恢復(fù)至室溫使用,上樣進(jìn)行垂直電泳,用10%SDSPAGE膠分離,轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,PVDF膜用含有5%脫脂奶粉的TBST溶液封閉1 h后,用TBST溶液平衡5 min,再與相應(yīng)一抗(1∶1 000)在4℃共搖床孵育過(guò)夜,PVDF膜用TBST洗4次,每次5 min,加相應(yīng)二抗(1∶5 000)在室溫共搖床孵育1 h,再用TBST洗4次,每次5 min。在暗房?jī)?nèi)用發(fā)光劑發(fā)光,顯影,定影,分析。

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,數(shù)據(jù)用x-±s表示,兩組間比較采用成組計(jì)量資料t檢驗(yàn),多組間比較采用方差分析(ANOVA分析),P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 CSE刺激對(duì)人巨噬細(xì)胞HDAC總活性的影響與對(duì)照組比較,CSE可以明顯抑制HDAC總活性(P<0.05),紅霉素預(yù)孵育24 h稍減輕 CSE對(duì)HDAC總活性的抑制作用,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。作為陰性對(duì)照組,HDAC的特異性抑制劑TSA組的HDAC總活性被抑制(P<0.05),見(jiàn)圖1。

    2.2 紅霉素對(duì)CSE刺激的人巨噬細(xì)胞HDAC3蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較,CSE可以明顯抑制HDAC3蛋白表達(dá),紅霉素預(yù)孵育24 h能明顯減輕CSE對(duì)HDAC1蛋白表達(dá)的抑制作用。作為陰性對(duì)照組,HDAC的特異性抑制劑TSA組的HDAC3表達(dá)明顯被抑制(P<0.05),見(jiàn)圖2A、B。

    2.3 紅霉素對(duì)CSE刺激的人巨噬細(xì)胞NF-κB蛋白表達(dá)的影響及HDAC特異性抑制劑TSA對(duì)NF-κB蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較,CSE可以明顯增強(qiáng)NF-κB的蛋白表達(dá),紅霉素預(yù)孵育24 h可抑制CSE對(duì)NF-κB蛋白表達(dá)的上調(diào)作用;同時(shí),HDAC特異性抑制劑TSA可以增強(qiáng) NF-κB的蛋白表達(dá)(P<0.05),見(jiàn)圖3A、B。

    圖2 紅霉素對(duì)香煙煙霧刺激的人巨噬細(xì)胞HDAC3蛋白表達(dá)影響Fig.2 Effect of EM on CSE-induced HDAC3 protein expression in human macrophages

    圖3 紅霉素對(duì)香煙煙霧刺激的人巨噬細(xì)胞NF-КB蛋白表達(dá)影響Fig.3 Effects of EM on CSE-induced NF-κB protein expression in human macrophages

    圖1 紅霉素對(duì)香煙煙霧刺激的人巨噬細(xì)胞HDAC總活性的影響Fig.1 Effect of EM on CSE-induced change in histone deacetylase(HDAC)activity in human macrophages

    圖4 紅霉素對(duì)香煙煙霧刺激的人巨噬細(xì)胞釋放TNF-α的影響Fig.4 Effect of EM on CSE-induced TNF-α protein release in human macrophages

    2.4 紅霉素對(duì)CSE刺激的人巨噬細(xì)胞釋放TNF-α的影響 與對(duì)照組比較,CSE組細(xì)胞上清中的TNF-α含量明顯增高(P<0.05),紅霉素預(yù)孵育24 h能明顯抑制 CSE對(duì)細(xì)胞 TNF-α的上調(diào)作用(P<0.05),見(jiàn)圖4。

    3 討論

    組蛋白乙?;福℉AT)和組蛋白去乙?;福℉DAC)是調(diào)節(jié)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的酶,因此影響炎癥基因的表達(dá)[11,12]。具有內(nèi)源性組蛋白乙?;富钚缘暮诵慕M蛋白的乙?;瘜?dǎo)致染色質(zhì)解旋致轉(zhuǎn)錄因子和RNA聚合酶II結(jié)合到DNA上,促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄。增強(qiáng)的組蛋白的乙酰化可以加強(qiáng)炎癥基因的表達(dá)。核心組蛋白的去乙?;ǔEc轉(zhuǎn)錄抑制相關(guān)[11,13]。HDACs可以抑制組蛋白的乙酰化,HDAC從組蛋白賴(lài)氨酸殘基上轉(zhuǎn)移乙?;?,致DNA纏繞、阻礙了基本轉(zhuǎn)錄單位蛋白質(zhì)復(fù)合物進(jìn)入啟動(dòng)子結(jié)合位點(diǎn),導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄功能受到抑制。HDACs在抑制基因表達(dá)以及抑制核心組蛋白的過(guò)度乙?;矫嫫鹬匾饔茫?4]。HDACs家族包含四個(gè)組 18 亞型[15]。I型(HDAC1,2,3,8,11)已被證明在調(diào)控細(xì)胞增殖和炎癥反應(yīng)中起重要作用,HDAC3是HDACs中的一個(gè)重要亞型,可通過(guò)組蛋白去乙?;饔茫{(diào)控染色質(zhì)重構(gòu)和炎癥基因的表達(dá)[15]。

    最近有研究報(bào)道,香煙煙霧引起HDAC表達(dá)下降[10,16],香煙煙霧降低 HDAC1,2,3 蛋白表達(dá)水平[10],因此影響炎癥基因的表達(dá)[17]。在這項(xiàng)研究中,我們觀察到香煙煙霧引起人巨噬細(xì)胞HDAC總活性下降的同時(shí),HDAC3蛋白表達(dá)明顯下降,提示HDAC3在香煙煙霧所誘導(dǎo)的炎癥機(jī)制中起重要作用。本研究同時(shí)顯示,紅霉素明顯減輕香煙煙霧引起人巨噬細(xì)胞HDAC3蛋白表達(dá)下降,提示紅霉素能夠活化HDAC3,顯著增加HDAC3蛋白的表達(dá)含量,這提示為紅霉素具有對(duì)抗香煙煙霧誘導(dǎo)氧化應(yīng)激所導(dǎo)致的炎癥的分子學(xué)作用機(jī)制之一;此外,實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示紅霉素可提高HDAC總活性,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,可能與樣本量小有關(guān)。

    研究結(jié)果進(jìn)一步顯示,香煙煙霧引起巨噬細(xì)胞HDAC3蛋白表達(dá)下降的同時(shí),誘導(dǎo)增強(qiáng)NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性和蛋白表達(dá),釋放TNF-α增多;HDAC特異性抑制劑TSA抑制HDAC總活性和HDAC3蛋白表達(dá)的同時(shí),促使 NF-κB蛋白表達(dá)增強(qiáng),提示HDAC3調(diào)控NF-κB表達(dá),香煙煙霧通過(guò)抑制HDAC總活性和HDAC3蛋白表達(dá),誘導(dǎo)增強(qiáng)NF-κB蛋白表達(dá),促進(jìn)巨噬細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)TNF-α,從而誘導(dǎo)炎癥。既往一些研究支持我們的結(jié)果,HDAC1,2,3通過(guò)直接或間接改變核轉(zhuǎn)錄因子如NF-κB的活性從而在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[15]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果同時(shí)顯示紅霉素不僅可增加HDAC3蛋白表達(dá),并且抑制香煙煙霧誘導(dǎo)增強(qiáng)的 NF-кB活性,抑制TNF-α釋放,提示紅霉素通過(guò)增加HDAC3蛋白的表達(dá)含量,進(jìn)而抑制香煙煙霧誘導(dǎo)增強(qiáng)的NF-κB活性和 TNF-α釋放,從而對(duì)抗香煙煙霧所誘導(dǎo)的炎癥。

    綜上所述,香煙煙霧引起炎癥介質(zhì)的釋放,與HDAC3的調(diào)控有關(guān)。紅霉素可抑制香煙煙霧誘導(dǎo)的炎癥,主要與紅霉素活化HDAC3,進(jìn)而抑制炎癥介質(zhì)合成和釋放相關(guān),實(shí)驗(yàn)結(jié)果為紅霉素治療與吸煙密切相關(guān)的氣道慢性炎癥性疾病如慢性支氣管炎、慢性阻塞性肺疾病、吸煙的支氣管哮喘患者等提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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    [收稿2013-09-25 修回2014-01-08]

    (編輯 許四平)

    Effect of erythrom ycin on cigarette smoke-induced histone deacetylase-3 protein expression in human macrophages

    LIMei-Hua,ZHONGXiao-Ning,WENMing-Zhi,HEZhi-Yi,PENGXin-Yan.DepartmentofRespiratoryMedicine,theFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China

    Objective:To study the effect of erythromycin(EM)on cigarette smoke-induced histone deacetylase-3(HDAC3)protein expression in human macrophages in vitro.Methods:The Aqueous cigarette smoke extract(CSE)was always prepared fresh on the day of the experiment.The U937 monocytic cellswere differentiated intomacrophages by using phorbol12-myristate 13-acetate(PMA)according to standard procedures.The U937 differentiated cells were treated with either CSE(1%)or EM(1 μg/ml)pretreatment,and HDAC inhibitor trichostatin A(TSA;100 ng/ml)for 24 h.HDAC activity wasmeasured with a colorimetric assay kit and Western blotwas used for HDAC3 and factor nuclear-kappaB(NF-κB)protein assays.The levels of tumor necrosis factor-α(TNF-α)release in the supernatantwere determined by enzyme linked immunosorbentassay(ELISA).Results:CSE(1%)significantly decreased HDAC activity and HDAC 3 protein levels at24 h.Preincubation with EM(1μg/ml)for 24 h significantly inhibit CSE(1%)induced decrease of HDAC3 protein expression.Furthermore,Preincubation with EM(1 μg/ml)for 24 h significantly inhibit NF-κB activity and TNF-α release in humanmacrophages.Conclusion:EM is able to restore HDAC3 levels decreased by cigarette smoke and inhibit NF-κB activity resulting in decreasing CSE-mediated TNF-α release,which has shown an importantexplanation that EM possess the anti-inflammatory effect induced by cigarette smoke.

    Erythromycin;histone deacetylase 3;Cigarette smoke

    R965

    A

    1000-484X(2014)05-0600-05

    10.3969/j.issn.1000-484X.2014.05.006

    ①本文為國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.30760085)、國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81360012)及廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳自籌經(jīng)費(fèi)科研課題(No.Z2012076)。

    李梅華(1975年-),女,博士,副教授,碩士生導(dǎo)師,主要從事慢性阻塞性肺疾病的發(fā)病機(jī)制及防治研究。

    及指導(dǎo)教師:鐘小寧(1959年-),男,博士,教授,博士生導(dǎo)師,主要從事慢性阻塞性肺疾病的發(fā)病機(jī)制及防治研究。

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