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    HBV突變與HBV相關(guān)慢加急性肝衰竭相關(guān)性研究

    2014-01-28 08:26:46張愛民王慧芬李桂英段學(xué)章
    傳染病信息 2014年2期
    關(guān)鍵詞:突變率核苷酸基因突變

    張愛民,王慧芬,李桂英,李 玉,段學(xué)章

    HBV 相關(guān)慢加急性肝衰竭(acute-on-chronic liver failure,ACLF)臨床病情危重、發(fā)展迅速、治療方法少,病死率高達50%~80%[1]。機體感染HBV 后可有不同的臨床結(jié)局,由病毒、肝細(xì)胞和宿主免疫系統(tǒng)相互作用決定。HBV 感染后的發(fā)病機制是免疫誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷[2],ACLF 則可能是這種免疫應(yīng)答的異常反應(yīng)[3]。因此,病毒及機體免疫反應(yīng)就成為乙型肝炎發(fā)病機制的兩個主要因素。截止目前,病毒或免疫因素如何作用導(dǎo)致肝衰竭的發(fā)生仍然沒有明確的定論,HBV 突變是當(dāng)下研究熱點[4-5]。本研究選取87例HBV 相關(guān)ACLF 患者為研究對象,以52例慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)、51例肝硬化(liver cirrhosis,LC)為對照,對HBV 前C(pre-core,PC)區(qū)、C 區(qū)、基本核心啟動子(basal core promoter,BCP)區(qū)的13 個基因位點進行測序,對比不同患者之間PC 區(qū)、C 區(qū)和BCP 區(qū)核苷酸突變率的差異,探討其與ACLF 之間的相關(guān)性。

    1 對象與方法

    1.1 對象 選取2010年1月—2012年4月于我院住院診治的慢性HBV 感染者190例。所有患者均為血清HBV DNA 陽性,未曾進行干擾素和(或)核苷(酸)類似物抗病毒治療,經(jīng)病史及實驗室檢查明確為感染6 個月以上。排除甲、丙、丁、戊型肝炎病毒重疊感染;排除合并CMV、EB 病毒和HIV 感染;排除合并自身免疫性肝炎、脂肪肝及酒精性肝病。肝衰竭診斷符合2006年《肝衰竭診療指南》[6],慢性肝炎及肝硬化診斷符合2010年《慢性乙型肝炎防治指南》[7]。

    1.2 實驗室檢測

    1.2.1 生化及病毒學(xué)指標(biāo)檢測 患者肝功能(ALT、AST、TBIL 和ALB)、凝血功能(PT、PA 和國際標(biāo)準(zhǔn)化比值)、HBV M 及HBV DNA 定量檢測等為住院期間由我院臨床檢驗醫(yī)學(xué)中心完成。

    1.2.2 HBV 基因型、亞型和PC 區(qū)、C 區(qū)、BCP 區(qū)突變位點的檢測

    1.2.2.1 引物設(shè)計與合成 根據(jù)HBV 基因組文庫數(shù)據(jù),采用Primer 5.0 軟件,針對S 基因保守區(qū)共設(shè)計2 對巢式引物對HBV 進行分型。對B 和C 亞型采用半巢式,突變位點為巢式引物,引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成(表1)。

    1.2.2.2 基因組DNA 提取和PCR 擴增

    表1 HBV 基因分型和突變位點的引物序列Table1 HBV genotype classification and gene mutation primers

    1.2.2.2.1 標(biāo)本采集和保存 上述標(biāo)本均取自患者外周靜脈血,干燥管靜置2 h,以3000 r/min 離心10 min,分離血清分裝于1.5 ml EP 管中,保存于-80 ℃冰箱,統(tǒng)一檢測。

    1.2.2.2.2 基因組DNA 提取和PCR 擴增 參照Tiangen 試劑盒說明,取先證者及其12 名家系成員外周靜脈血。提取全血白細(xì)胞基因組DNA,-20 ℃保存?;蚪MDNA 模板行PCR 擴增。反應(yīng)體系包括:基因組DNA 50 ng、上下游引物各0.5 μl(10 pmol)、dNTP(2.5 mmol)2 μl、rTaq 酶(TaKaRa 公司,日本)1 U、2×GC buffer Ⅰ緩沖液補充雙蒸水至20 μl。PCR 應(yīng)用ABI 9700 熱循環(huán)儀,條件:95 ℃預(yù)變性5 min,95 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,循環(huán)35 次,72 ℃再延伸10 min。

    1.2.2.3 PCR 產(chǎn)物純化、測序及序列分析 PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,純化后分別對擴增引物測序(北京華大基因研究中心),結(jié)果采用DNAStar 軟件子程序SeqMan 分析。

    1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用Stata 11.0 軟件對數(shù)據(jù)進行分析。正態(tài)分布的連續(xù)性數(shù)據(jù)如年齡、HBV DNA 用±s 表示,非正態(tài)分布的連續(xù)性數(shù)據(jù)如血清膽紅素、ALT、PA 水平用中位數(shù)(最小值,最大值)表示。3 組間率的比較采用R×C χ2檢驗,兩兩多重比較用Scheffe 法。發(fā)生ACLF 影響因素用logistic 回歸分析。P <0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    2.1 一般資料 190例慢性HBV 感染者中包括52例CHB(CHB 組)、51例LC(LC 組)和87例ACLF(ACLF 組)?;颊吣挲g、性別、入組時肝功能和凝血功能等見表2。

    2.2 190例BCP 區(qū)、前C 區(qū)和C 區(qū)基因突變分布 檢測190例的BCP 區(qū)、前C 區(qū)和C 區(qū)基因突變位點為1753(T→C/G)、1754(T→C)、1758(T→C)、1762(A →T)、1764(G →A)、1766(C →T)、1768(T→A)、1846(A →T)、1858(T→C)、1862(G →T)、1896(G→A)、1899(G→A)和1913(C→A/G)。CHB組的全陰數(shù)為12例(23.1%),遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于LC 組和ACLF 組的0例(0%)和3例(3.5%)。CHB、LC、ACLF 3 組的13 個突變位點的總突變數(shù)分別為120、181、335 個,人均核苷酸突變檢出率分別為2.31、3.55、3.86 個。ACLF 組 中T1754G、T1758C、C1766T、T1768A、G1862T、T1858C 發(fā)生突變的病例數(shù)分別為7、5、7、4、1、4例,故未對這6 個位點的突變情況進一步分析統(tǒng)計。T1753C、A1762T、G1764A和G1899A 這4 個突變位點,LC 組核苷酸突變率高于CHB 組。A1762T、A1846T、G1899A 和C1913(A/G)4 個突變位點在ACLF 組和CHB 組之間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義,CHB 組核苷酸突變率低于ACLF組。G1764A、A1846T 和C1913(A/G)在ACLF 組和LC 組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義,G1764A 位點突變率在LC 組高于ACLF 組,A1846T 和C1913(A/G)位點突變率在LC 組低于ACLF 組(表3)。

    表2 CHB、LC 和ACLF 組臨床及病毒學(xué)特征Table2 Clinical and virological characteristics in patients with CHB,LC and ACLF

    按患者在慢性肝炎或肝硬化基礎(chǔ)上發(fā)生ACLF,分為ACLF-CHB 組和ACLF-LC 組,分別為29例和58例,比較CHB 組和ACLF-CHB 組、LC組和ACLF-LC 組基因突變差異。結(jié)果提示A1846T和C1913(A/G)位點突變率在CHB 組低于ACLFCHB 組,在LC 組低于ACLF-LC 組(表4)。

    表3 CHB、LC 和ACLF 組HBV 基因突變比較[例(%)]Table3 Comparison of HBV mutations among patients with CHB,LC and ACLF [cases (%)]

    2.3 ACLF 發(fā)病影響因素的多因素分析 將HBeAg 是否陽性、HBV 基因分型是否為C 型及是否發(fā)生1753(T→C/G)、1762(A→T)、1764(G→A)、1846(A→T)、1899(G→A)和1913(C→A/G)位點突變設(shè)為自變量,是否發(fā)生ACLF 為因變量,進行l(wèi)ogistic 回歸分析。自變量賦值如下:X1(HBeAg 陽性=1、陰性=0),X2(HBV 基因C 型=1、B 型=0),X3[1753(C/G)=1、1753T=0)],X4(1762T=1、1762A=0),X5(1764A=1、1764G=0),X6(1846T=1、1846A=0),X7(1899A=1、1899G=0),X8(1913A/G=1、1913C=0),Y(發(fā)生ACLF=1、不發(fā)生ACLF=0)。結(jié)果表明1846(A→T)和1913(C→A/G)的OR 值分別為2.86 和5.93,均為發(fā)生ACLF 的危險因素(P<0.05)。見表5。

    表4 CHB 組與ACLF-CHB、LC 與ACLF-LC 組HBV 基因突變比較[例(%)]Table4 Comparison of HBV mutations between patients with CHB and ACLF-CHB,and between LC and ACLF- LC[cases (%)]

    表5 ACLF 發(fā)病相關(guān)多因素分析Table5 Multivariable analysis of the occurrence of HBV-related ACLF

    3 討 論

    HBV 基因突變是CHB 疾病進展過程中在宿主的免疫壓力下病毒的正向選擇結(jié)果,突變株一般可減少病毒蛋白的產(chǎn)生,是病毒逃避免疫監(jiān)視的一種方式[8]。由于這種機制,HBV 突變隨著疾病的進展逐步累積,以致不同疾病階段突變率明顯不同[9]。本研究顯示CHB 組野生型HBV 占23.1%,遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于LC 和ACLF 組的0%和3.5%。CHB、LC和ACLF 3 組的人均HBV 核苷酸突變檢出率分別為2.31、3.55 和3.86 個。

    關(guān)于HBV 的PC 區(qū)突變株感染與肝臟病變輕重的關(guān)系意見不一,大多數(shù)報道認(rèn)為突變與肝臟病變程度相關(guān),尤其與肝衰竭的發(fā)生密切相關(guān)[10-12]。本研究顯示PC 區(qū)G1899A 位點突變在LC 和ACLF組高于CHB 組,但3 組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。BCP區(qū)突變影響病情的報道較多,本研究中A1762T 和G1764A 位點突變率LC 組高于CHB 組,G1764A 位點突變率LC 組高于ACLF 組,但CHB 組和ACLF組G1764A 位點突變率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義,故考慮G1764A 位點突變與肝硬化相關(guān),并不影響ACLF 的發(fā)生。A1846T 和C1913(A/G)位點突變率在CHB 組和LC 組均低于ACLF 組,但在CHB 組和LC 組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。按ACLF 發(fā)病基礎(chǔ)分為ACLF-CHB 和ACLF-LC 2 組,分別比較CHB組和ACLF-CHB 組、LC 組和ACLF-LC 組,結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn)A1846T 和C1913(A/G)位點突變率在CHB組低于ACLF-CHB 組,LC 組低于ACLF-LC 組,故推測可能A1846T 和C1913(A/G)位點突變與ACLF有關(guān)。為進一步排除干擾因素,找出對ACLF 有意義的預(yù)測因素,我們對上述單因素分析有統(tǒng)計學(xué)意義的指標(biāo)引入二項分類的logistic 回歸,應(yīng)變量為是否發(fā)生ACLF。引入分析的指標(biāo)有:HBeAg 狀態(tài)、HBV 基因分型、1753(T→C/G)、1762(A→T)、1764(G→A)、1846(A→T)、1899(G→A)和1913(C→A/G)。結(jié)果提示1846(A→T)和1913(C→A/G)位核苷酸突變是預(yù)測ACLF 的有效指標(biāo),OR 值分別為2.86 和5.93,提示1846(A→T)和1913(C→A/G)位點突變患者發(fā)生ACLF 的幾率分別是未發(fā)生突變患者的2.86 和5.93 倍。前期研究顯示A1846T 突變與肝臟炎癥及ACLF 發(fā)病有關(guān)[13-14],相關(guān)發(fā)病機制尚不清楚。nt1913 位于C 區(qū)起始部位,既往對此位點突變的相關(guān)文獻較少。由于該位點突變可引起HBcAg 第5 位氨基酸的突變(脯氨酸→蘇氨酸/丙氨酸),該氨基酸位于HBcAg 人類白細(xì)胞分類抗原Ⅱ限制性輔助性T 細(xì)胞抗原表位,故nt1913 突變可能會引起該表位的變化,從而影響病情的嚴(yán)重程度[15-17]。

    總之,ACLF 患者血清HBV 發(fā)生A1846T 和C1913(A/G)突變較CHB 和LC 患者更多,這一發(fā)現(xiàn)有助于了解不同肝病基礎(chǔ)上發(fā)生ACLF 的發(fā)病機制,并可能有助于預(yù)測慢性肝病是否發(fā)展為ACLF,但須進一步進行體外實驗來支持這一可能發(fā)病機制。

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