健脾清化方在腎小球硬化大鼠中抗腎纖維化的作用及其機(jī)制

陳 晛，何立群

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院腎病科上海市中醫(yī)重點(diǎn)臨床實(shí)驗(yàn)室，上海200021

1982年，Moorhead等［1］首次揭示 “脂質(zhì)腎毒性”，自此脂代謝紊亂作為腎小球硬化的獨(dú)立危險(xiǎn)因素開始受到研究者關(guān)注。研究證實(shí)脂質(zhì)可以參與調(diào)節(jié)MAPK信號(hào)通路［2-3］、促進(jìn)系膜細(xì)胞增殖［4］、刺激促纖維化細(xì)胞因子分泌［5］、介導(dǎo)炎癥反應(yīng)［6］、影響細(xì)胞外基質(zhì)合成與降解的平衡［7］，從而與其他因素共同推進(jìn)腎纖維化的進(jìn)展。其中，炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)聚集是腎纖維化的關(guān)鍵啟動(dòng)步驟和重要環(huán)節(jié)，已有大量證據(jù)表明，極低密度脂蛋白 (very low-density lipoprotein，VLDL)、中密度脂蛋白 (intermediate-density lipoprotein，IDL)、低密度脂蛋白 (low-density lipoprotein，LDL)及氧化修飾后的LDL(oxidized LDL，Ox-LDL)均可促進(jìn)系膜細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞產(chǎn)生腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素 (interleukin，IL)-6等多種炎性因子，加劇腎間質(zhì)的炎癥反應(yīng)［8］。TNF-α是一種具有多重生物活性的炎癥因子，不僅介導(dǎo)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，還可誘導(dǎo)多種巨噬細(xì)胞來(lái)源的促纖維化因子、炎癥因子釋放，刺激成纖維細(xì)胞增長(zhǎng)和過(guò)度堆積［9］，故其在加劇腎臟炎癥反應(yīng)中的作用不可忽視。健脾清化方是針對(duì)慢性腎功能衰竭患者脾虛與濕熱、瘀血、濁毒交雜的中醫(yī)病機(jī)，由李東垣的補(bǔ)脾胃瀉陰火升陽(yáng)湯化裁而來(lái)的臨床經(jīng)驗(yàn)方劑，可明顯改善腎功能及纖維化指標(biāo)［10-12］。前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)從改善腎臟血液動(dòng)力學(xué)及氧化應(yīng)激的角度觀察和解釋了該方對(duì)5/6腎切除大鼠腎纖維化的治療作用［13］。本研究采用新的腎纖維化動(dòng)物模型，即腎切除聯(lián)合阿霉素誘導(dǎo)局灶節(jié)段性腎小球硬化大鼠模型，觀察了該方對(duì)模型大鼠血脂及腎組織TNF-α的影響，以期從改善腎臟炎癥的角度闡述該方對(duì)新模型腎纖維化的治療作用及其機(jī)制。

材料和方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性SD大鼠56只，2月齡，清潔級(jí)，體重 (200±20)g，由上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，在上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)喂養(yǎng)，自由進(jìn)食和飲水，封閉管理。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

藥物健脾清化方由黨參15 g、生黃芪15 g、草果仁6 g、蒼術(shù)10 g、黃連3 g、制大黃9 g組成。益氣健脾拆方由黨參15 g、生黃芪15 g組成。清熱化濕拆方由草果仁6 g、蒼術(shù)10 g、黃連3 g、制大黃9 g組成。以上藥材由曙光醫(yī)院東院中藥房統(tǒng)一進(jìn)貨。水煎濃縮為含生藥2 g/ml的藥液。尿毒清顆粒購(gòu)自廣州康臣藥業(yè)有限公司 (國(guó)藥準(zhǔn)字Z1097122)。

試劑血清總膽固醇 (total cholesterol，TC)、三酰甘油 (triglyceride，TG)、LDL試劑盒購(gòu)自北京北化康泰臨床試劑有限公司。VLDL ELISA試劑盒購(gòu)自上海裕平生物科技有限公司。TNF-α ELISA試劑盒購(gòu)自英國(guó)Abcam公司 (ab100785)。

造模及分組取56只SD大鼠采用抽簽法隨機(jī)分為3組，8只大鼠為正常組;40只為造模組，均建立左側(cè)腎切除聯(lián)合阿霉素誘導(dǎo)局灶節(jié)段性腎小球硬化模型;8只為假手術(shù)組，不結(jié)扎血管且不切除左腎。造模組大鼠于手術(shù)1周后尾靜脈注射阿霉素溶液3 mg/kg，手術(shù)5周后再次尾靜脈注射阿霉素溶液3 mg/kg;假手術(shù)組注射同等體積的生理鹽水。以血肌酐顯著高于正常組 (P＜0.05)為造模成功的標(biāo)準(zhǔn)。成模后根據(jù)血肌酐值采用分層隨機(jī)法將造模組大鼠分為5組 (模型組、健脾清化方組、益氣健脾組、清熱化濕組、尿毒清組，n=8)，使5組間血肌酐差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

藥物干預(yù)及標(biāo)本采集正常組、假手術(shù)組、模型組喂以固定動(dòng)物飼料和自來(lái)水。健脾清化方組、益氣健脾組、清熱化濕組分別給予相應(yīng)治療藥液0.5 g/100 g，每日灌胃1次;尿毒清組給予尿毒清顆粒0.5 g/100 g，每日灌胃1次。連續(xù)8周后處死。無(wú)菌取血及腎組織，腎組織勻漿后取上清液，置于-80°冰箱中冷凍保存。

觀察指標(biāo)血清TC和TG采用酶法測(cè)定，血清LDL采用選擇性沉淀法測(cè)量，血清VLDL和腎組織TNF-α采用ELISA法測(cè)定，步驟參照試劑盒說(shuō)明書。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

血脂指標(biāo)結(jié)果比較造模成功后第8周，假手術(shù)組血清TC、TG、LDL及VLDL水平與正常組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P均＞0.05);模型組血清TC、TG、LDL及VLDL水平均顯著高于正常組及假手術(shù)組 (P均＜0.01);健脾清化方組、清熱化濕組及尿毒清組血清TC、TG、LDL及VLDL水平均顯著低于模型組(P均＜0.01)，益氣健脾組血清TC、TG及VLDL水平顯著低于模型組 (P均＜0.01)，但LDL水平與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)(表1)。

腎組織TNF-α測(cè)定結(jié)果比較造模成功后第8周，假手術(shù)組腎組織TNF-α水平與正常組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05);模型組腎組織TNF-α水平顯著高于正常組及假手術(shù)組 (P均＜0.01);健脾清化方組、清熱化濕組、尿毒清組腎組織TNF-α表達(dá)水平均顯著低于模型組 (P均＜0.01)，而益氣健脾組與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)(表1)。

討 論

脾腎虛衰、濕熱、瘀血、濁毒作為幾種極為重要的病理因素，共同構(gòu)成中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)對(duì)于腎纖維化病機(jī)的認(rèn)識(shí)體系。幾大病理因素相互交錯(cuò)、相互轉(zhuǎn)化形成了腎纖維化復(fù)雜的“正虛邪實(shí)”的病理狀態(tài)，其中以脾腎虛衰為本，水濕內(nèi)蘊(yùn)、瘀血濁毒留滯為標(biāo)，故臨床治療中補(bǔ)脾益腎、通腑瀉濁、活血利濕是關(guān)鍵?！夺t(yī)方考》有云:“下焦之病，責(zé)于濕熱。”臨床觀察顯示，慢性腎病兼夾濕熱證者占65% ～85%［14-15］。實(shí)驗(yàn)也表明，非透析慢性腎功能衰竭且伴有微炎癥狀態(tài)的患者，其中醫(yī)辨證中夾有濕熱證者，微炎癥狀態(tài)程度最明顯［16］?；跐駸嵩谀I臟炎癥狀態(tài)中的重要地位，健脾清化方確立“益氣健脾與清熱化濕為主，同時(shí)兼用活血化瘀及通腑瀉濁”的遣方用藥思路，方中采用黨參、黃芪益氣健脾以扶正治本，脾氣健旺則水濕可化，另以大黃黃連清熱、蒼術(shù)草果燥濕以治標(biāo)，大黃尚可通腑瀉濁、活血化瘀，六藥合用，能使正氣漸旺，濕熱、瘀血、濁毒消退。前期實(shí)驗(yàn)證明，健脾清化方能有效降低C反應(yīng)蛋白水平及炎癥細(xì)胞因子IL-2、IL-6、IL-17 和干擾素-γ 的表達(dá)［17-18］。

研究提示，脂質(zhì)成分及其代謝產(chǎn)物廣泛參與腎組織炎癥反應(yīng)及纖維化進(jìn)展。脂蛋白可激發(fā)小管上皮細(xì)胞釋放內(nèi)皮素、單核細(xì)胞趨化蛋白-1、血小板源生長(zhǎng)因子、骨調(diào)素等，并能改變上皮細(xì)胞整合素的表達(dá)和分布［19］，介導(dǎo)細(xì)胞黏附和炎癥損傷;可促進(jìn)系膜細(xì)胞分泌IL-6、血小板源生長(zhǎng)因子，促進(jìn)系膜增殖和炎癥反應(yīng)［8］;可刺激單核細(xì)胞及腎臟固有細(xì)胞產(chǎn)生轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β (transforming growth factor-β，TGF-β)，導(dǎo)致多種炎癥因子的表達(dá)增強(qiáng)。Ox-LDL在腎小球損傷時(shí)可與巨噬細(xì)胞的清道夫受體結(jié)合，刺激生長(zhǎng)因子、炎癥因子的產(chǎn)生，使炎癥反應(yīng)加劇，還可上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞中的細(xì)胞間黏附分子、血管細(xì)胞黏附分子、β2整合素水平，增強(qiáng)單核細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞作用，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)［19］。TNF-α是炎性介質(zhì)網(wǎng)絡(luò)中的重要成員，不僅可積聚炎癥細(xì)胞，還能單獨(dú)或與IL-1協(xié)同增加系膜細(xì)胞合成前列腺素E，增加血小板源生長(zhǎng)因子和花生四烯酸的釋放［8］，并能增加血管活性物質(zhì)、主要組織相容性抗原、黏附分子等表達(dá)，增強(qiáng)炎癥反應(yīng);同時(shí)促進(jìn)免疫活性細(xì)胞產(chǎn)生 IL-1、單核細(xì)胞趨化蛋白-1、TGF-β等細(xì)胞因子，促進(jìn)脂質(zhì)釋放［19］，共同推進(jìn)腎臟炎癥反應(yīng)的進(jìn)程。

在腎纖維化過(guò)程中，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和聚集、炎癥因子和促纖因子刺激肌成纖維細(xì)胞形成是導(dǎo)致腎纖維化的必經(jīng)步驟，另外，部分炎癥因子如IL-1、TNF-α也具有很強(qiáng)的促纖維化作用，因此炎癥是啟動(dòng)和推進(jìn)腎纖維化的關(guān)鍵。

臨床及藥理研究發(fā)現(xiàn)，諸多中藥可改善脂質(zhì)代謝紊亂，對(duì)TNF-α產(chǎn)生積極影響，如黃芪中所含的黃芪多糖、大黃中所含的大黃多糖可降低血清TC、TG及LDL［20-21］，黃連中所含的小檗堿可明顯降低血清TC、TG及 VLDL［22］;大黃所含的大黃素、黃芪可抑制TNF-α生成［23-24］。健脾清化方即是在上述諸藥基礎(chǔ)上構(gòu)成。

本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠腎組織中TNF-α的表達(dá)與正常組比較明顯升高，提示腎硬化大鼠腎組織存在明顯的炎癥反應(yīng)，而健脾清化組的腎組織TNF-α水平與模型組比較顯著降低，其效果與臨床常用藥物尿毒清比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果提示健脾清化方改善腎功能及腎纖維化的機(jī)制可能與降低TNF-α表達(dá)，從而改善腎組織的炎癥狀態(tài)有關(guān)。清熱化濕組與模型組比較TNF-α水平也顯著降低，而益氣健脾組與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步說(shuō)明健脾清化方中清熱化濕、活血瀉濁藥物是降低TNF-α表達(dá)的主要有效成分。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)，與正常組及假手術(shù)組比較，模型組大鼠血脂顯著上升，說(shuō)明腎小球硬化大鼠存在脂質(zhì)代謝紊亂，經(jīng)健脾清化方干預(yù)后，大鼠的血清TC、TG、LDL、VLDL水平均顯著降低，且與尿毒清組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示健脾清化方改善腎功能及腎纖維化的機(jī)制可能還與全面有效糾正脂質(zhì)代謝紊亂，進(jìn)而改善腎臟炎癥狀態(tài)有關(guān)。其拆方益氣健脾方、清熱化濕方在降低TC、TG、VLDL方面亦有明顯效果，但在改善血清LDL方面，益氣健脾組與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示健脾清化方中的清熱化濕、活血瀉濁藥物對(duì)于降低LDL水平起著主要作用。

綜上，本研究采用臨床驗(yàn)方健脾清化方干預(yù)腎小球硬化模型大鼠，結(jié)果顯示其能明顯下調(diào)血清各類脂質(zhì)及腎組織TNF-α的表達(dá)，故可有效改善模型大鼠的腎臟炎癥狀態(tài)，最終達(dá)到抗腎纖維化的效果。

［1］Moorhead JF，Chan MK，El-Nahas M，et al.Lipid nephrotoxicity in chronic progressive glomerular and tubulo-interstitial disease［J］.Lancet，1982，2(8311):1309-1311.

［2］Song HM，Wei M，Xu K，et al.Differential effect of three mitogen-activated protein kinases on lipoprotein(a)-induced human mesangial cell proliferation［J］.Chin Med J(Engl)，2010，123(2):216-220.

［3］Hong HK，Song CY，Kim BC，et al.ERK contributes to the effects of Smad signaling on oxidized LDL-induced PAI-1 expression in human mesangial cells［J］.Transl Res，2006，148:171-179.

［4］Xia JM，Zhang J，Zhou WX，et al.Downregulation of p38 MAPK involved in inhibition of LDL-induced proliferation of mesangial cells and matrix by curcumin ［J］.J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci，2013，33(5):666-671.

［5］Chatauret N，F(xiàn)avreau F，Giraud S，et al.Diet-induced increase in plasma oxidized LDL promotes early fibrosis in a renal porcine auto-transplantation model［J/OL］.J Transl Med，2014，12:76［2014-09-03］.http://www.translationalmedicine.com/content/12/1/76.

［6］Vaziri ND，Navab M，F(xiàn)ogelman AM.HDL metabolism and activity in chronic kidney disease［J］.Nat Rev Nephrol，2010，6(5):287-296.

［7］Yao XM，Ye SD，Zai Z，et al.Simvastatin protects diabetic rats against kidney injury through the suppression ofrenal matrix metalloproteinase-9 expression ［J］.J Endocrinol Invest，2010，33(5):292-296.

［8］ 王海燕.腎臟病學(xué) ［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2008:735-792.

［9］胡新民，盧玲，呂冬寧，等.中醫(yī)藥抗腎纖維化中對(duì)TNF-α影響的研究進(jìn)展 ［J］.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志，2005，6(11):681-682.

［10］陳剛，何立群.健脾清化方對(duì)不同蛋白飼料喂養(yǎng)慢性腎衰竭大鼠腎功能及血脂的影響 ［J］.上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，21(3):66-68.

［11］陳剛，何立群.健脾清化方治療慢性腎衰竭53例臨床觀察［J］.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志，2006，7(10):591-593.

［12］陳晛，何立群.健脾清化方對(duì)腎纖維化大鼠腎功能、蛋白尿及腎組織Col-IV表達(dá)的影響 ［J］.南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，29(6):548-552.

［13］鄒赟，朱祎，邵命海，等.健脾清化方對(duì)5/6腎切除大鼠ATII/NADPH氧化應(yīng)激通路的干預(yù)作用［J］.中南大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2013，38(8):779-784.

［14］孫偉，曾安平，嚴(yán)志林，等.濕熱病邪與慢性腎病關(guān)系探討——附152例臨床資料分析 ［J］.中醫(yī)研究，2000，13(1):36-37.

［15］余江毅，熊寧寧，余承惠.慢性腎病瘀血與濕熱病理的臨床和實(shí)驗(yàn)研究 ［J］.遼寧中醫(yī)雜志，1995，22(2):91-92.

［16］朱辟疆，周遜，趙華，等.慢性腎功能衰竭微炎癥狀態(tài)與中醫(yī)證型關(guān)系研究［J］.現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2008，17(5):652-653.

［17］吳鋒，孫悅，張彤，等.健脾清化方對(duì)CKD2～3期患者慢性微炎癥狀態(tài)的隨機(jī)對(duì)照多中心研究［J］.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志，2012，13(6):504-506.

［18］何立群，侯衛(wèi)國(guó)，沈沛成，等.健脾清化方治療脾虛濕熱型慢性腎衰的臨床療效及細(xì)胞分子機(jī)制研究［J］.上海中醫(yī)藥雜志，2006，40(4):6-8.

［19］李婭.血脂與腎間質(zhì)纖維化 ［J］.國(guó)外醫(yī)學(xué)內(nèi)科學(xué)分冊(cè)，2001，28(10):429-432.

［20］陳國(guó)輝，黃文鳳.黃芪的化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展［J］.中國(guó)新藥雜志，2008，17(17):1482-1485.

［21］王苑銘，田林紅，張娟.大黃多糖對(duì)糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化大鼠血糖、血脂、肝脂酶活性的影響［J］.中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)藥雜志，2008，10(4):6-9.

［22］王秀杰.黃連的藥理研究及現(xiàn)代應(yīng)用 ［J］.中國(guó)藥師雜志，2003，6(6):370.

［23］潘華新，王培訓(xùn)，周聯(lián)，等.清熱、活血類中藥有效成分對(duì)THP-1巨噬泡沫細(xì)胞形成及分泌IL-1β、TNF-α的影響［J］.現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2009，18(35):4325-4327，4329.

［24］陳莉芬，李榮亨，曹文富，等.黃芪對(duì)慢性腎炎患者血清TNF-α、IL-6及細(xì)胞免疫功能的影響 ［J］.重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，27(2):174-176.