賀建超,賀聰瑩,盧美歡,馬英輝,王瑪麗
(1.陜西省微生物研究所,陜西 西安 710043;2.西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,陜西 西安 710069)
〈育種與馴化〉
雙孢蘑菇和姬松茸滅活原生質(zhì)體融合育種研究
賀建超1,賀聰瑩2,盧美歡1,馬英輝1,王瑪麗2
(1.陜西省微生物研究所,陜西 西安 710043;2.西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,陜西 西安 710069)
以雙孢蘑菇和姬松茸為親本菌株,通過滅活原生質(zhì)體融合,經(jīng)過初篩和復(fù)篩,1株新的穩(wěn)定的雙孢蘑菇和姬松茸雜交高產(chǎn)菌株被選育出來。雙孢蘑菇原生質(zhì)體被熱滅活(65℃,30 min),姬松茸原生質(zhì)體被紫外線滅活(30 w,30 cm,10 min),雙親存活率為3.1×10-7~3.3×10-8。在聚乙二醇誘導(dǎo)下融合繼續(xù)生存,親本原生質(zhì)體融合被實(shí)現(xiàn),重組頻率為4.8×10-5。
雙孢蘑菇;姬松茸;滅活原生質(zhì)體;融合;重組子
自從1977年以來,人們開始了用滅活原生質(zhì)體進(jìn)行微生物融合育種的嘗試[1]。雙孢蘑菇和姬松茸同是蘑菇屬不同種間的食用菌,為了將它們的優(yōu)良特性結(jié)合在一起,人工創(chuàng)造新品種,采用滅活原生質(zhì)體融合技術(shù),經(jīng)過多年的研究,得到了雙孢蘑菇和姬松茸融合重組子。對(duì)融合重組子進(jìn)行了多代選育,獲得了性狀穩(wěn)定的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)雜交新菌株。現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。
1.1 供試菌株
雙孢蘑菇(Agaricusbisporus)2796-1、姬松茸(Agaricusblazei)M1,均系陜西省微生物研究所保藏菌株。
1.2 供試培養(yǎng)基
綜合PDA 培養(yǎng)基:土豆200 g、蛋白胨2 g、酵母膏2 g、硫酸鎂0.5 g、磷酸二氫鉀0.5 g、磷酸氫二鉀1 g、葡萄糖20 g、維生素B110 mg、瓊脂粉20 g,蒸餾水 1 000 mL;再生培養(yǎng)基(RM):綜合PDA培養(yǎng)基加入甘露醇0.6 mol;液體再生培養(yǎng)基(LRM):綜合PDA培養(yǎng)基不加瓊脂粉,另外加入硫酸鎂0.6 mol。
1.3 混合酶液
中科院生物物理所生產(chǎn)的蝸牛酶10 mg·mL-1,中科院上海生化所生產(chǎn)的纖維素酶10 mg·mL-1,用0.6 mol硫酸鎂作等滲液,pH5.8磷酸鹽緩沖液配制。酶溶解后 5 000 r·min-1,離心10 min去掉沉淀雜質(zhì),上清液再用滅菌G6漏斗過濾除菌。
1.4 融合劑
用0.6 mol硫酸鎂和0.01 mol氯化鈣配制的30%聚乙二醇(PEG),分子量為 6 000D(日本進(jìn)口分裝)。滅菌備用。
1.5 原生質(zhì)體的分離與再生
收集25℃三角瓶液體培養(yǎng)6 d~8 d菌絲體1 g,加10 mL混合酶液輕微震蕩,在小三角瓶中酶解脫壁。30℃水浴酶解4 h,原生質(zhì)體產(chǎn)量達(dá)到最高峰。G3漏斗過濾殘余菌絲體,用0.6 mol·L-1硫酸鎂洗滌2次,收集原生質(zhì)體懸浮液20 mL。用血球計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù),雙孢蘑菇原生質(zhì)體濃度為3.6×108個(gè)·mL-1,姬松茸原生質(zhì)體濃度為3.4×108個(gè)·mL-1。
將制備的原生質(zhì)體懸浮液分別用液體再生培養(yǎng)基和無菌水稀釋,25℃預(yù)培養(yǎng)24 h,取0.1 mL涂布于再生平板培養(yǎng)基上,25℃培養(yǎng)8 d~10 d,兩者菌落數(shù)之差,除以顯微計(jì)數(shù)原生質(zhì)體數(shù),即為原生質(zhì)體再生頻率。雙孢蘑菇和姬松茸原生質(zhì)體再生頻率分別為2.4%和2.1%[2]。
1.6 原生質(zhì)體滅活與融合
取雙孢蘑菇原生質(zhì)體懸浮液10 mL,65℃水浴滅活30 min,檢測(cè)存活率為3.1×10-7;取姬松茸原生質(zhì)體懸浮液10 mL倒入直徑20 cm 無菌平皿中,在30 W紫外燈管正下方30 cm 處,打開皿蓋照射滅活處理10 min,檢測(cè)存活率為3.3×10-8。
將兩親株滅活的原生質(zhì)體各取1 mL混合到無菌帶塞的離心管內(nèi),加入1 mL 30℃預(yù)熱的聚乙二醇,2 000 r·min-1離心20 min,30℃溫浴10 min,以5 mL 0.6 mol·L-1硫酸鎂洗滌2次,再用液體再生培養(yǎng)基作系列稀釋,25℃預(yù)培養(yǎng)24 h,取0.1 mL 涂布平板再生培養(yǎng)基,25℃繼續(xù)培養(yǎng)8 d~10 d,挑選融合重組子再生菌株60株,移接于綜合PDA斜面培養(yǎng)基上,25℃培養(yǎng)滿管,4℃冰箱保存?zhèn)溆肹3]。
2.1 滅活原生質(zhì)體融合頻率
雙孢蘑菇2796-1和姬松茸M1原生質(zhì)體分別采用熱滅活和紫外線滅活法處理,混合后在聚乙二醇誘導(dǎo)下發(fā)生融合,融合后重組頻率為4.8×10-5。
2.2 融合重組子鑒定
拮抗作用:在60株融合子中有85%的菌株與雙親菌株形成了明顯的拮抗線,融合子之間也有拮抗但不明顯。
出菇試驗(yàn):雙孢蘑菇2796-1和姬松茸M1融合子從F1~F3代性狀分離,其規(guī)律不同于孟德爾分離規(guī)律[2]。取典型的雙親性狀的子實(shí)體做組織分離,進(jìn)行純化培養(yǎng)。繼續(xù)栽培6次,觀察選擇獲得了性狀穩(wěn)定的雙孢蘑菇和姬松茸雜交高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)新菌株。新菌株菌絲潔白粗壯,生長(zhǎng)速度快。子實(shí)體形態(tài)和顏色介于兩親本之間,麥草牛糞發(fā)酵培養(yǎng)料栽培周期為6個(gè)月,每千克干料可產(chǎn)鮮蘑菇0.54 kg。有顯著的雜交優(yōu)勢(shì),抗雜菌能力超過雙親菌株。
2.3 融合重組子分析
雙孢蘑菇和姬松茸采用滅活原生質(zhì)體融合技術(shù)可以獲得理想的雜交新菌株。選擇親緣關(guān)系較遠(yuǎn),且具有互補(bǔ)優(yōu)勢(shì)的菌株為親本,有利于雜交優(yōu)勢(shì)的體現(xiàn)[4]。雙親滅活原生質(zhì)體融合的特點(diǎn)是可以省去遺傳標(biāo)記菌株的篩選,還有利于排除雙方親本類型的再生菌株的干擾,便于選擇融合重組子。熱滅活必須配合其它滅活方式,雙親菌株原生質(zhì)體均用熱滅活法處理,致死損傷部位都一樣,融合后得不到互補(bǔ),就得不到融合子再生菌株。雙親菌株原生質(zhì)體均用紫外線滅活法處理。又會(huì)通過UV處理在不同位點(diǎn)上損傷DNA,因而有可能使融合子的某些代謝途徑受到干擾,或許影響產(chǎn)量。但它可以刺激雙親菌株基因組間的交換,這是紫外線滅活法的優(yōu)點(diǎn)。因此,我們選用了雙孢蘑菇原生質(zhì)體熱滅活,姬松茸原生質(zhì)體紫外線滅活,融合后雙方原生質(zhì)體損傷部位得到互補(bǔ),我們就很容易從再生平板上,挑選出融合子再生菌株。
[1]周東坡,平文祥. 微生物原生質(zhì)體融合[M]. 哈爾濱:黑龍江科學(xué)技術(shù)出版社,1990:301-304.
[2]劉振岳,泰立芳,張偉. 細(xì)胞工程株平香1號(hào)培育簡(jiǎn)報(bào)[J]. 食用菌,1995(6):7-8.
[3]賀建超,賀榆霞. 木耳滅活原生質(zhì)體融合育種研究[J]. 中國(guó)食用菌,2003,22(5):16-17.
[4]張樹庭,林方燦. 蕈菌遺傳與育種[M]. 北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,1997:96.
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Study on the Breeding ofAgaricusbisporusandAgaricusblazeiby Inactivated Protoplast Fusion
HE Jian-chao1, HE Cong-ying2, LU Mei-huan1, MA Ying-hui1, WANG Ma-li2
(1.Shaanxi Institute of Microbiology, Xi’an Shanxi 710043; 2.College of Life Science, Northwest University, Xi’an Shanxi 710069)
In this study, a new steady, high-yield strain was obtained by inactivated protoplast fusion of the parent strain ofAgaricusbisporusandAgaricusblazeithrough primary and secondary screening.AgaricusbisporusandAgaricusblazeiprotoplast was inactivated with heating (65℃, 30 min) and UV light (30 w, 30 cm, 10 min) respectively. The livability of both was about 3.1×10-7~3.3×10-8. By the inducer of polyethylene glycol, the parent protoplast fusion was carried out with a recombination freguency of 4.8×10-5.
Agaricusbisporus;Agaricusblazei; Inactivated protoplasts; Fusion; Recon
賀建超(1963-),男,副研究員,長(zhǎng)期從事食用菌遺傳育種工作。
2013-11-16
S646.9
A
1003-8310(2014)01-0009-02