高濕環(huán)境對大鼠免疫功能的影響*

郭 鑫，李 昆，王 超，李 薇，楊 蕓，宋富強，呼永河

高濕環(huán)境能引起人體常見的多種疾病，高濕度是導(dǎo)致這些疾病的重要因素及發(fā)病條件［1］。我國幅員遼闊，氣候環(huán)境復(fù)雜多變，尤其是南方和沿海地區(qū)，大部分處于中、亞熱帶氣候，常年多雨，叢林分布廣，湖泊及河流密布，或者接近海洋，水資源豐富。這些地區(qū)全年濕度均偏高，高濕致病因素影響的范圍極為廣闊。近年來，隨著SARS、禽流感等與濕度因素相關(guān)的新的疾病的出現(xiàn)，使得高濕環(huán)境下導(dǎo)致疾病的病因?qū)W及病理機制的研究顯得更為緊迫和重要。免疫力是機體抵御疾病的屏障系統(tǒng)，了解高濕條件下機體免疫力的改變，有利于為改善高濕引起各種疾病的狀況提供新的思路。前期的研究認(rèn)為，濕度變化可能是影響人體免疫功能的重要因素［2，3］，然而，高濕環(huán)境下機體免疫力到底如何變化，其隨著時間的發(fā)展又會有怎樣的結(jié)果，目前并不十分清楚。本研究對不同濕化時間的大鼠模型進行免疫學(xué)方面的檢測，旨在探討其變化的規(guī)律及意義，并為高濕影響機體免疫功能機制的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

健康 SD雄性大鼠30只，體重（200±20）g，由四川達(dá)碩實驗動物公司提供。異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記小鼠抗大鼠CD3單抗，R-藻紅蛋白（R-PE）標(biāo)記小鼠抗大鼠 CD4單抗，別藻藍(lán)蛋白（Allophycocyanine）標(biāo)記小鼠抗大鼠CD8單抗購自美國BECKMAN公司。固定劑及紅細(xì)胞裂解液購自德國PARTEC公司。人工氣候箱為RXZ-1000A型，由中國寧波江南儀器廠制造。流式細(xì)胞儀購自德國PARTEC公司CYFLOW ML型。全自動生化分析儀為日本OLYMPUSAU400。

1.2 高濕模型建立

將30只健康雄性SD大鼠分為三組（n＝10）：常溫常濕組、濕化20 d組和40 d組，其中濕化組大鼠放入人工氣候箱培養(yǎng)，濕度（RH）為（90±2）%，溫度（T）為（26±2）℃，每日刺激 10 h，其余時間條件與常溫常濕組大鼠相同，分別于20 d、40 d處死，采集血液和脾臟標(biāo)本。常溫常濕組條件 RH＝（55±5）%，T＝（26±2）℃。

1.3 外周血T淋巴細(xì)胞亞群測定

采集高濕組和常溫常濕組大鼠外周靜脈血，EDTA抗凝。（1）取抗凝血25μl分別加人各流式檢測管中，然后分別加人熒光素標(biāo)記的抗大鼠單克隆抗體 CD3-FITC、CD4-PE、CD8-APC，并設(shè)立同型對照和空白對照，室溫避光孵育30 min；（2）加入 30μl固定劑，混勻后室溫避光放置15 min；（3）加入2 ml溶血素，避光 37℃水浴 30 min，待測；（4）采用 PARTEC公司CYFLOW ML型流式細(xì)胞儀，同時開啟藍(lán)色和紅色激光器，接收數(shù)據(jù)通道為 FL1、FL4和 FL5，在FLOMAX2.8軟件下獲取與分析數(shù)據(jù)。以 FSC／SSC設(shè)定淋巴細(xì)胞門，根據(jù)對照調(diào)整好實驗參數(shù)，每管檢測1萬個細(xì)胞。

1.4 脾組織T淋巴細(xì)胞亞群測定

采集高濕組和常溫常濕組大鼠脾臟于培養(yǎng)皿中，PBS沖洗3次。外科手術(shù)剪反復(fù)剪碎后，用200目篩網(wǎng)過濾收集細(xì)胞，并于4℃，2 000 r／min離心10 min，棄上清；加入2 ml溶血素重懸細(xì)胞，靜置5～10 min，4℃，2 000 r／min離心 10 min，棄上清；加入 PBS重懸細(xì)胞，4℃，2 000 r／min離心 10 min，棄上清；加入PBS，重懸細(xì)胞后，取20μl按照外周血的方法進行標(biāo)記和固定，最后調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×106cells／ml，上機檢測，每管檢測1萬個細(xì)胞。

1.5 血清 IgG、IgA、IgM抗體及補體 C3水平的檢測

采集高濕組和常溫常濕組大鼠外周靜脈血2 ml，4 000 r／min離心 10 min，取血清在全自動生化分析儀上，用透射比濁法檢測。檢測試劑、校準(zhǔn)品及質(zhì)控均為原裝配套試劑，質(zhì)控結(jié)果在允許范圍內(nèi)才能進行實驗檢測。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，所有結(jié)果均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示，組間比較采用 t檢驗進行分析。

2 結(jié)果

2.1 外周血T淋巴細(xì)胞亞群測定結(jié)果

濕化大鼠外周血總的T淋巴細(xì)胞水平變化不大，其比例均為50%左右，與常溫常濕組相比沒有顯著性差異。CD4＋的T淋巴細(xì)胞比例在20 d組顯著上升，與常溫常濕組相比有統(tǒng)計學(xué)差異，而40 d組CD4＋的T淋巴細(xì)胞比例也升高，但與常溫常濕組相比沒有統(tǒng)計學(xué)的差異。CD8＋的T淋巴細(xì)胞比例隨著時間的推移，呈現(xiàn)了先降低再升高的趨勢，其中20 d組在統(tǒng)計學(xué)上有顯著性差異，40 d組則與常溫常濕組細(xì)胞比例幾乎一致。CD4＋／CD8＋結(jié)果與CD4＋的T淋巴細(xì)胞亞群結(jié)果類似，在20 d組顯著升高以后，40 d組持續(xù)降低，最終數(shù)據(jù)結(jié)果接近常溫常濕組的水平（表1，圖1）。

Fig.1 Flow cytometry results of Tlymphocyte subsets in peripheral blooda：FS vs SStwo parameter scatter diagram；b：CD4-PC7 vs CD3-FITC two parameter scatter diagram；c：CD8-APC vs CD3-FITC two parameter scatter diagram；d-f：CD3-FITC、CD4-PC7、CD8-APC single parameter histogram

2.2 脾組織T淋巴細(xì)胞亞群測定結(jié)果

濕化大鼠脾臟CD3＋T淋巴細(xì)胞結(jié)果顯示，20 d組比例降低，40 d組升高，但與常溫常濕組相比均沒有統(tǒng)計學(xué)差異。CD4＋T淋巴細(xì)胞結(jié)果趨勢與CD3＋T淋巴細(xì)胞類似，隨著時間推移先降低再升高，與常溫常濕組相比無統(tǒng)計學(xué)差異。CD8＋T淋巴細(xì)胞20 d組結(jié)果與常溫常濕組有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），比例顯著降低，40 d組亦降低，但無統(tǒng)計學(xué)差異。CD4＋／CD8＋在20 d組與40 d組的水平均略有升高，但與常溫常濕組相比均沒有顯著性差異（表2，圖 2）。

Fig.2 Flow cytometry results of T lymphocyte subsets in spleena：FS vs SS two parameter scatter diagram；b：CD4-PC7 vs CD3-FITC two parameter scatter diagram；c：CD8-APC vs CD3-FITC two parameter scatter diagram；d-f：CD3-FITC、CD4-PC7、CD8-APCsingle parameter histogram

2.3 血清IgG、IgA、IgM抗體及補體C3檢測結(jié)果

濕化大鼠20 d組和40 d組血清IgG的含量均低于正常組大鼠，但未見統(tǒng)計學(xué)差異，而IgA與IgM變化不大。濕化大鼠20天組補體C3顯著上升（P＜0.05），40 d組結(jié)果與正常對照組相比沒有顯著性差異（表 3）。

3 討論

環(huán)境的應(yīng)激對機體的免疫功能有一定的影響，普遍的觀點認(rèn)為，強烈而持久的應(yīng)激可能會導(dǎo)致免疫功能的降低。高濕環(huán)境有其特殊的環(huán)境條件和致病機理，我國許多傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的研究者在濕度因素致病免疫學(xué)機理的研究中提出了許多寶貴經(jīng)驗。張六通等［4］研究發(fā)現(xiàn)，在相對濕度（RH）＞90%，溫度（T）（18～25）℃，連續(xù)刺激 12 h／d，連續(xù)觀察 108 d的條件下，高濕致病組大鼠出現(xiàn)T淋巴細(xì)胞總數(shù)不足、T淋巴細(xì)胞亞群異常以及白介素2活性下降，提示高濕可能導(dǎo)致了T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫功能的低下。陳剛［5］除對高濕模型大鼠進行了免疫功能的研究外，還設(shè)無菌組大鼠，即在相對無菌的環(huán)境中建立高濕模型大鼠，并進行相關(guān)免疫功能的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)無菌組高濕模型大鼠亦存在免疫功能的紊亂，揭示外界濕度在沒有微生物參與的情況下，也能對機體免疫功能產(chǎn)生較大影響。

T淋巴細(xì)胞是介導(dǎo)細(xì)胞免疫的主要效應(yīng)細(xì)胞，T淋巴細(xì)胞亞群的比值是反映機體免疫功能變化的主要指標(biāo)。正常狀態(tài)下，T淋巴細(xì)胞及其亞群的數(shù)目在周圍組織中相對穩(wěn)定，而病理條件下，CD4＋／CD8＋的比值則可能發(fā)生變化，提示免疫功能發(fā)生紊亂。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，濕化大鼠外周血總的T淋巴細(xì)胞水平變化不大，而CD4＋T淋巴細(xì)胞在20 d組顯著上升，CD8＋T淋巴細(xì)胞則顯著降低，其比值顯著升高。40 d組變化趨勢與20 d組相似，但是差異不明顯。這提示高濕環(huán)境在開始階段作為一種應(yīng)激因素對機體產(chǎn)生了刺激，導(dǎo)致免疫系統(tǒng)的自穩(wěn)狀態(tài)發(fā)生改變，CD4＋與CD8＋比例出現(xiàn)變化，其比值顯著上升，免疫系統(tǒng)功能增強。這與 Carlini［6］等的研究結(jié)果一致，他們通過濕邪致病大鼠IL-2、IL-8水平變化探討濕邪致病與細(xì)胞免疫功能的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)外濕組的IL-2和IL-8水平比內(nèi)濕組和常溫常濕組明顯升高，提示濕邪致病初期外濕與機體的免疫功能提高和炎癥反應(yīng)密切有關(guān)，此階段機體可能對外在濕邪較內(nèi)在濕邪的刺激更為敏感。之后隨著時間的延長，機體對高濕刺激因素慢慢適應(yīng)，可能逐漸習(xí)服，表現(xiàn)為CD4＋、CD8＋T淋巴細(xì)胞及其比值逐漸降低至常溫常濕組水平。大鼠脾臟T淋巴細(xì)胞亞群整體變化不大，濕化20 d組大鼠CD8＋T淋巴細(xì)胞亞群有統(tǒng)計學(xué)差異，其數(shù)據(jù)顯著降低，這進一步說明在高濕環(huán)境初期，機體免疫功能提高，殺傷性的T淋巴細(xì)胞發(fā)揮了直接的作用，此后隨著機體的不斷調(diào)整可能逐漸習(xí)服，T淋巴細(xì)胞亞群比例逐漸接近正常水平。

Tab.2 Levels of T lymphocyte subsets in spleen in control and high humidity groups（ˉx±s，n＝10）

Tab.3 Results of humoral immunity index in blood serum of control and high humidity groups（g／l，ˉx±s，n＝10）

體液免疫是機體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，IgG、IgM、IgA等免疫球蛋白以及補體系統(tǒng)都對機體的免疫系統(tǒng)發(fā)揮了重要作用。實驗結(jié)果顯示，20 d組的C3有較大幅度地升高，有統(tǒng)計學(xué)差異。以往的研究表明，應(yīng)激對補體的活性和含量起抑制作用［7，8］，這也提示我們，高濕應(yīng)激可能不同于其余的應(yīng)激因素，它能夠顯著提高機體C3的含量，在體液免疫總體降低的情況下，短效地提升機體的防御能力。隨著時間的推移，機體通過自我調(diào)整，補體C3基本回復(fù)到正常狀態(tài)，最終表現(xiàn)為與常溫常濕組無顯著性差異。

本研究說明了在高濕環(huán)境下大鼠機體內(nèi)免疫狀態(tài)的變化，即實驗初期大鼠的免疫自穩(wěn)狀態(tài)發(fā)生變化，功能得以增強，隨著時間的延長，機體通過自我的調(diào)整，可能逐漸習(xí)服，免疫功能降低到正常水平。這使我們初步明確了高濕環(huán)境對機體免疫功能的影響，并進一步了解了濕化時間與機體免疫狀態(tài)的關(guān)系，對我們下一步研究高濕環(huán)境影響機體免疫功能的機制具有一定的指導(dǎo)意義。

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