籽鵝卵泡顆粒細(xì)胞烯醇化酶過表達(dá)模型的建立及其對孕酮分泌的影響*

張偉宏，計 紅，王江璐，赫榮賀，楊煥民

卵泡生長發(fā)育及其成熟排卵是一個復(fù)雜的過程。卵泡的生長發(fā)育需要消耗大量的能量，研究表明糖酵解是卵巢內(nèi)卵泡發(fā)育主要的供能方式［1］。α-烯醇化酶 （α-enolase，ENO1）作為糖酵解酶［2］，若在顆粒細(xì)胞中高表達(dá)，可能會促進(jìn)相關(guān)激素分泌從而進(jìn)一步促進(jìn)卵泡發(fā)育。

禽類無黃體，其孕酮（progesterone）可直接作用于腺垂體，引起促黃體生成素（luteotropic hormone，LH）釋放，誘發(fā)排卵。研究發(fā)現(xiàn)，蛋雞的產(chǎn)蛋性能與其血漿P4的含量成平行關(guān)系，且孕酮是排卵前LH峰形成的關(guān)鍵刺激信號。因此，研究禽類孕酮的分泌調(diào)節(jié)對雌禽產(chǎn)蛋啟動和維持具有重要意義。

近年來，關(guān)于禽類生殖激素與產(chǎn)蛋性能的相關(guān)研究很多，但關(guān)于ENO1是否能促進(jìn)相關(guān)激素分泌進(jìn)而促進(jìn)鵝卵泡排卵尚未見報道。本研究以東北籽鵝為實驗動物，構(gòu)建籽鵝卵泡顆粒細(xì)胞烯醇化酶過表達(dá)模型，并應(yīng)用ELISA方法檢測顆粒細(xì)胞中ENO1過表達(dá)對孕酮分泌的影響，為進(jìn)一步探討ENO1與籽鵝卵泡發(fā)育之間的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與器材

ENO1過表達(dá)載體由本實驗室構(gòu)建保存；M199培養(yǎng)液（賽默飛世爾生物化學(xué)制品（北京）有限公司）；胎牛血清 Solarbio（Beijing Solarbio Technology Co.Ltd.）；Trizol Reagent（Invitrogen，美國）；ENO1引物、βactin引物（上海生工公司合成）；反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒（Perfect Real Time）（購自中國大連 TaKaRa公司）；318-Microplate Reader（上海三科儀器有限公司）；Goose Prog ELISA Kit（美國 RD）。

1.2 實驗動物和顆粒細(xì)胞分離方法

8月齡健康雌性籽鵝（大慶市大同種鵝場飼養(yǎng)）。籽鵝頸靜脈放血致死，取F1級卵泡，參考Gillbert等［3］介紹的方法，剝離顆粒細(xì)胞層。將剝離后的顆粒細(xì)胞膜置于0.9%生理鹽水中清洗后，可選擇用培養(yǎng)液再次清洗2～3次，盡量去除卵黃物質(zhì)。用小剪刀將顆粒細(xì)胞膜剪成約1 mm3大小的小塊，用 12.5μg／mlⅠ型膠原酶，37℃消化 5～6 min，吹打數(shù)次，將細(xì)胞膜混合液于200目濾網(wǎng)過濾，制備得到粗制的顆粒細(xì)胞懸液，將濾液離心3次（1 000 r／min，8 min），清洗殘存的膠原酶，以及細(xì)胞碎片和少許的卵黃物質(zhì)。沉淀的顆粒細(xì)胞加入10.0%胎牛血清M199培養(yǎng)液制備成顆粒細(xì)胞懸液備用。取少量細(xì)胞懸液加入等體積0.1%臺盼藍(lán)，用血球計數(shù)板計數(shù)，細(xì)胞存活率在90%以上。

1.3 籽鵝卵泡顆粒細(xì)胞生長曲線的繪制

1.3.1 細(xì)胞計數(shù)法 分離顆粒細(xì)胞以2×105cells／ml密度接種于96孔板的40個孔，體積分?jǐn)?shù)5%CO2，37℃CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。每天取4個孔的細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)取平均值，每5 d換液，連續(xù)10 d。以培養(yǎng)時間軸為橫軸，細(xì)胞數(shù)為縱軸（對數(shù)），繪制生長曲線。

1.3.2 WST-1法 分離顆粒細(xì)胞以 2×105cells／ml密度接種于96孔板的40個孔，體積分?jǐn)?shù)5%CO2，37℃CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。每天取4個孔的細(xì)胞，每孔加入200μl配置好的WST-1工作液，37℃，孵育4 h，將96孔板置于搖床上搖動1 min，以充分混勻待檢測體系。在450 nm測定吸光度。

1.4 ENO1腺病毒過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)顆粒細(xì)胞模型的建立

將分離的顆粒細(xì)胞以1×106cells／ml的密度接種于12孔板，置于5%O2，37℃恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察，培養(yǎng)的顆粒細(xì)胞約12孔板底約70%～80%時，換液。加入含有ENO1過表達(dá)病毒的病毒培養(yǎng)液。根據(jù)相關(guān)資料，以不同感染復(fù)數(shù)值（multiplicity of infection，MOI）100、250、350和 400 pfu／cell，將ENO1腺病毒過表達(dá)載體液轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的顆粒細(xì)胞。該腺病毒載體攜帶增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因（GFP），于感染后 24 h、48 h，在熒光顯微鏡下觀察GFP的表達(dá)。熒光顯微鏡下觀察感染率大約98%～100%時，細(xì)胞狀態(tài)良好時，即符合實驗后續(xù)要求。設(shè)置ENO1過表達(dá)組、腺病毒空載體組、培養(yǎng)液組，依據(jù)篩選出的最佳MOI和培養(yǎng)時間進(jìn)行試驗，收集細(xì)胞懸液和細(xì)胞備用。

1.5 ENO1 mRNA的表達(dá)

Trizol法提取顆粒細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄生成cDNA。ENO1的上游引物：5′-GCGGTGCCTCAACTGGAA TT-3′，下 游 引物：5′-CCATGTCCAGCATCAGTTTGTC-3′，擴(kuò)增片段大小為183 bp。GAPDH為內(nèi)參，上游引物：5′-GCTGATGCTCCCATGTTCGTGAT-3′，下游引物：5′-GTGGTGCAAGAGGCATTGCTGAC-3′，擴(kuò)增片 段 大小為86 bp。所有引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。熒光定量 PCR擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性10 s，94℃ 5 s，56℃ 30 s，72℃ 20 s，45個循環(huán)。

1.6 ENO1的表達(dá)

收集培養(yǎng)液組、腺病毒空載組和ENO1過表達(dá)組細(xì)胞，用PBS清洗，加入細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白，應(yīng)用Bradford比色法檢測蛋白含量。每個樣品槽內(nèi)60μl樣本進(jìn)行SDS-PAGE電泳，通過電轉(zhuǎn)法將蛋白從聚丙烯酰胺凝膠上轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，轉(zhuǎn)印后的PVDF膜用5%脫脂奶粉4℃封閉過夜后加入一抗（濃度 1∶500），37℃孵育 2 h，TBST洗膜后加入濃度為1∶3 000的二抗（羊抗兔），37℃孵育2 h，TBST洗膜，LICOR Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)掃描出圖像。

1.7 雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗 ELISA法檢測細(xì)胞上清液中孕酮含量

收集培養(yǎng)液組、腺病毒空載組和ENO1過表達(dá)組細(xì)胞上清液，3 000 r／min，離心10 min去除顆粒和聚合物。-20℃保存。從室溫平衡20 min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣品孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μl；樣本孔先加待測樣本10μl，再加樣本稀釋液40μl；空白孔不加。除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測抗體100μl，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60 min。棄去液體，吸水紙上吸干，每孔加滿洗滌液（×20洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1∶20稀釋，即1份的×20洗滌緩沖液加19份的蒸餾水），靜置1 min，甩去洗滌液，吸水紙上吸干，如此重復(fù)5次（也可用洗板器洗板）。每孔加入底物A、B各50μl，37℃避光孵育 15 min。每孔加入終止液50μl，15 min內(nèi)，在450 nm波長處測定各孔的OD值。

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：在Excel工作表中，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，對應(yīng)OD值作縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線，按曲線方程計算各樣本濃度值。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件處理，進(jìn)行ANOVA對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果

2.1 ENO1腺病毒過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)顆粒細(xì)胞

熒光倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)MOI為100和200時，細(xì)胞生長良好，但即使培養(yǎng)48 h，感染率仍然較低，當(dāng)MOI為350轉(zhuǎn)染48 h，觀察可發(fā)現(xiàn)感染可達(dá)100%，且細(xì)胞依然生長良好，細(xì)胞凋亡不明顯。當(dāng)MOI增至400時，轉(zhuǎn)染24 h，即可見細(xì)胞生長狀態(tài)差，縮成圓形，細(xì)胞內(nèi)空泡增多，逐步趨向凋亡。綜合細(xì)胞生長狀態(tài)和轉(zhuǎn)染率，當(dāng) MOI為350，轉(zhuǎn)染48 h為ENO1腺病毒過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染籽鵝顆粒細(xì)胞最佳條件（圖 1）。

2.2 細(xì)胞生長曲線繪制

細(xì)胞計數(shù)法和WST-1法所作的生長曲線均表現(xiàn)為1～2 d生長緩慢，2～6 d進(jìn)入對數(shù)生長期并增殖到高峰，7～10 d細(xì)胞生長處于停滯狀態(tài)并逐漸進(jìn)入衰亡期（圖2）。

2.3 熒光定量檢測ENO1 mRNA表達(dá)情況

培養(yǎng)液組和腺病毒空載體組ENO1 mRNA表達(dá)量無明顯差異；與培養(yǎng)液組和腺病毒空載體組相比，過表達(dá)組中ENO1 mRNA表達(dá)量升高極顯著（P＜0.01）。

2.4 Western blot結(jié)果

2.4.1 ENO1與β-actin的表達(dá) Western blot檢測培養(yǎng)液組、腺病毒空載體組和ENO1過表達(dá)組中ENO1與β-actin蛋白表達(dá)結(jié)果，47 kD處為ENO1，43 kD處為β-actin（圖 3）。

2.4.2 ENO1／β-actin半定量分析結(jié)果 對培養(yǎng)液組、腺病毒空載體組和過表達(dá)組間ENO1反應(yīng)條帶進(jìn)行半定量分析，與培養(yǎng)液組和腺病毒空載體組進(jìn)行比較，培養(yǎng)液組和腺病毒空載體組進(jìn)行比較無明顯差異，與培養(yǎng)液組和腺病毒空載體組相比較，過表達(dá)組中ENO1表達(dá)極顯著升高（P＜0.01）。

2.5 ELISA檢測細(xì)胞上清液中孕酮含量

與培養(yǎng)液組和腺病毒空載體組相比較，ENO1過表達(dá)組孕酮量極顯著增多（P＜0.01，圖5）。

Fig.1 Granulosa cell transfected with different titers of adenavirus and transfected time（×200）A：Light microscope；B：Fluorescence microscope；A1：MOI＝100，24 h；B1；MOI＝100，24 h；A2：MOI＝100，48 h；B2；MOI＝100，48 h；A3：MOI＝250，24 h；B3；MOI＝250，24 h；A4：MOI＝250，48 h；B4：MOI＝250，48 h；A5：MOI＝350，24 h；B5：MOI＝350，24 h；A6：MOI＝350，48 h；B6：MOI＝350，48 h；A7：MOI＝400，24 h；B7：MOI＝400，24 h

Fig.2 Growth Curve

Fig.3 Western blot assay detected ENO1 expression1：Control group；2：Ad-CMV-Null group；3：Ad-CMVENO1 group；M：Mark；ENO1：α-enolase

Fig.4 ENO1 protein in different groups1：Control group；2：Ad-CMV-Null group；3：Ad-CMV-ENO1 group；ENO1：α-enolase**P＜0.01 vs control group，＃＃P＜0.01 vs Ad-CMVNull group

Fig.5 Progesterone in different groups1：Control group；2：Ad-CMV-Null group；3：Ad-CMV-ENO1 group；ENO1：α-enolase**P＜0.01 vs control group，＃＃P＜0.01 vs Ad-CMVNull group

3 討論

細(xì)胞的生命活動時刻需要能量的供給，ENOl正是通過調(diào)節(jié)細(xì)胞的產(chǎn)能過程，維持細(xì)胞ATP水平，保證細(xì)胞的存活及其生理功能的執(zhí)行。ENO1在細(xì)胞能量代謝過程中起重要的作用，許多快速增殖的細(xì)胞或者組織主要是通過糖酵解途徑獲取能量。卵巢卵泡是生長最快的正常組織之一，而與卵母細(xì)胞一起構(gòu)成卵泡的顆粒細(xì)胞與內(nèi)膜細(xì)胞的分化則是其生長的主要原因。有研究顯示糖酵解是卵巢內(nèi)卵泡發(fā)育主要的供能方式，即葡萄糖通過內(nèi)膜血管進(jìn)入卵泡中參加相關(guān)能量代謝，在顆粒細(xì)胞中發(fā)生糖酵解反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)籽鵝快速生長的卵泡中ENO1相對表達(dá)量是原始卵泡中表達(dá)量的 2.34倍（P＜0.05）［4］，所以我們推測 ENO1過表達(dá)可能通過促進(jìn)卵泡顆粒細(xì)胞的增殖和分化及有關(guān)激素分泌，進(jìn)而調(diào)控卵泡發(fā)育。顆粒細(xì)胞是體外研究禽類卵泡發(fā)育的良好模型。卵泡顆粒細(xì)胞核膜細(xì)胞的相互作用是卵泡發(fā)育和維持正常功能的重要條件。因此我們首先構(gòu)建了籽鵝卵泡顆粒細(xì)胞ENO1過表達(dá)模型。

孕酮是一種類固醇激素［5］，可在卵巢內(nèi)合成，但在卵泡不同發(fā)育階段，顆粒細(xì)胞、膜細(xì)胞／基質(zhì)細(xì)胞、黃體細(xì)胞均能夠分泌孕酮。禽產(chǎn)蛋性能與性腺激素分泌水平密切相關(guān)，孕酮是其中一個重要的內(nèi)分泌激素。研究表明，排卵前大卵泡（F1-F6，直徑大于15 mm）顆粒細(xì)胞合成孕酮的能力隨卵泡成熟逐漸增強(qiáng)，F(xiàn)1卵泡時達(dá)到高峰［6］。顆粒細(xì)胞分泌孕酮增加，促進(jìn)LH峰出現(xiàn)，從而進(jìn)行排卵。本研究結(jié)果顯示ENO1過表達(dá)會促進(jìn)體外培養(yǎng)的顆粒細(xì)胞分泌孕酮量極顯著增加。由此推測ENO1過表達(dá)可能會促進(jìn)卵泡排卵。本試驗研究結(jié)果進(jìn)一步豐富禽類產(chǎn)蛋過程中激素分泌理論，為生產(chǎn)實踐和科學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

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