GRP78蛋白在胰腺癌中的表達(dá)及對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響研究

杜進(jìn)兵 李清華

GRP78蛋白在胰腺癌中的表達(dá)及對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響研究

杜進(jìn)兵①李清華①

目的：檢測(cè)葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)在胰腺癌組織中的表達(dá)，探討GRP78蛋白與胰腺癌發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)關(guān)系。觀察GRP78基因表達(dá)下調(diào)對(duì)胰腺癌細(xì)胞凋亡和增殖的影響，為以GRP78基因?yàn)榘谢蛑委熞认侔┨峁├碚撘罁?jù)。方法：利用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)93例胰腺癌組織及58例胰腺良性病變組織中GRP78蛋白的表達(dá)情況；Sh GRP78和Sh Neg克隆入真核表達(dá)載體，經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染胰腺癌細(xì)胞系BXPC-3，G418篩選陽性克隆，半定量RT-PCR檢測(cè)GRP78 mRNA表達(dá)，Western blot檢測(cè)GRP78蛋白表達(dá)。采用流式細(xì)胞儀、磺酰羅丹明B(SRB)染色法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖和凋亡情況。結(jié)果：GRP78蛋白在正常胰腺組織表達(dá)率為10.8%，在胰腺良性病變組織的表達(dá)率為41.4%，在胰腺癌組織中陽性率為88.2%，3組之間差異顯著。建立了2組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系：BXPC-3 sh GRP78和BXPC-3 sh Neg，BXPC-3 sh GRP78細(xì)胞中GRP78 mRNA和蛋白表達(dá)顯著下調(diào)。GRP78基因表達(dá)抑制后BXPC-3細(xì)胞的增殖明顯受到抑制，凋亡顯著增加。結(jié)論：GRP78蛋白在正常胰腺組織，胰腺良性病變組織及胰腺癌組織中的表達(dá)水平依次升高；GRP78基因高表達(dá)是細(xì)胞組織惡性轉(zhuǎn)化的重要標(biāo)志物。

葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78；胰腺癌；增殖;凋亡

[First-author’s address] Department of Medical Affairs, Wuhan General Hospital of Guangzhou Command, Wuhan 430070, China.

葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucoseregulatedprotein，GRP78)是一種主要的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶，其表達(dá)能夠被各種緊急情況及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力物質(zhì)激活，如葡萄糖缺乏、Ca2+體內(nèi)平衡的分布、氧化應(yīng)激和組織缺氧，反過來阻止內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中錯(cuò)誤折疊及解折疊蛋白的聚集。在其壓力下GRP78的誘導(dǎo)在維持細(xì)胞活性中起著重要作用[1]。由于癌癥血管形成能力弱及缺少營養(yǎng)，臟器腫瘤通常包含壓力微環(huán)境，如組織缺氧、酸中毒及糖缺乏，這些病理狀態(tài)可能導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力和誘導(dǎo)GRP78的過表達(dá)[2]。近年來，在各種癌細(xì)胞株、臟器腫瘤和人腫瘤活組織檢查中，GRP78的過表達(dá)被檢測(cè)出來并被認(rèn)為是腫瘤增殖、腫瘤血管生長及抗腫瘤藥物依賴過程中起著重要作用[3-4]。盡管有研究證實(shí)了GRP78在胰腺癌中的表達(dá)，但GRP78在胰腺癌中的表達(dá)改變機(jī)制仍不明確。本研究通過檢測(cè)GRP78 mRNA和蛋白表達(dá)水平在胰腺癌及正常胰腺組織中的表達(dá)，探討GRP78在胰腺癌組織中表達(dá)的意義。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本采集

收集廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院2010年1月至2011年8月手術(shù)切除的胰腺癌標(biāo)本93例(份)，胰腺良性病變(胰腺炎42例，胰腺囊腺瘤16例)標(biāo)本58例(份)，均經(jīng)病理證實(shí)。93例胰腺癌標(biāo)本中腫瘤直徑＜4 cm為42例，≥4 cm為51例；均為胰腺導(dǎo)管腺癌；TNM分期分別為I期22例，Ⅱ期20例，Ⅲ期34例，Ⅳ期17例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者59例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者34例。正常胰腺組織37例，取自外傷性胰腺損傷需切除部分胰腺。手術(shù)切除后新鮮胰腺組織標(biāo)本快速液氮冷凍，-80 ℃保存。

1.2 免疫組織化學(xué)染色法

采用免疫組織化學(xué)染色S-P法，按照試劑說明書進(jìn)行。GRP78一抗?jié)舛染鶠閘∶100。GRP78免疫反應(yīng)陽性物質(zhì)均定位于胞漿，隨機(jī)選取至少10個(gè)高倍鏡視野(×200)，至少計(jì)數(shù)l000個(gè)細(xì)胞以積分法計(jì)算結(jié)果，即根據(jù)每張切片的染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞比例計(jì)分。著色強(qiáng)度：無色0分；淺黃色1分；棕黃色2分；棕褐色3分。著色細(xì)胞比例：無著色0分；＜30%為1分；30%～60%為2分；≥60%為3分。兩者相加0～2分為弱陽性或陰性；3～4分為陽性；5～6分為強(qiáng)陽性。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

結(jié)腸癌細(xì)胞系BXPC-3細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究中心，加入含體積分?jǐn)?shù)為10%的牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d換液1次，待細(xì)胞密度達(dá)90%時(shí)胰酶消化傳代，實(shí)驗(yàn)選取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞種板。

1.4 GRP78 shRNA轉(zhuǎn)染及穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的篩選

加入0.25%的胰酶處理BXPC-3細(xì)胞后，按每孔4×104個(gè)細(xì)胞均勻加至96孔板中，當(dāng)細(xì)胞達(dá)85%～90%匯合時(shí)分別轉(zhuǎn)染GRP78-siRNA和pNegsiRNA質(zhì)粒(陰性對(duì)照用)，具體操作按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000說明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染24 h后將細(xì)胞以1∶10比例傳代，次日開始用含有500 μg/ml G418的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選培養(yǎng)，每3 d更換1次培養(yǎng)基，連續(xù)篩選3周，隨后將獲得的細(xì)胞克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染3周后的細(xì)胞為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染組。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)BXPC-3細(xì)胞中GRP78 mRNA的表達(dá)

分別取未轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染GRP78-siRNA組、轉(zhuǎn)染pNeg-siRNA組細(xì)胞加入Trizol試劑后勻漿，抽提總RNA并用Beckman Coulter DU800分光光度儀測(cè)定RNA的濃度和純度。按Primescript TM RT試劑盒說明書提供的方法將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)條件為37 ℃ 15 min、85 ℃5 s，將反應(yīng)產(chǎn)物置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩０碨YBR Premix Ex Taq TM試劑盒說明書提供的方法，以獲得的cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。GRP78上游引物序列為5’-GCTATTCGCAATCAGGGTTACAG-3’，下游引物序列為5’-TGGGATCCTCATGCTTGAATG-3’；β-actin(內(nèi)參照)上游引物序列為5’-CCCAGCACAATGAAGATCAAGATCAT-3’，下游引物序列為5’-ATCTGCTGGAAGGTGGACAGCGA-3’。 聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)條件：第1步，95 ℃1 min；第2步，95 ℃15 s、60 ℃15 s、72 ℃30 s，共40個(gè)循環(huán)。溶解曲線的反應(yīng)條件：95 ℃15 s，60 ℃1 min，95 ℃15 s。在ABIPrism7500 Sequence Detector System(序列檢測(cè)系統(tǒng)，美國ABI公司產(chǎn)品)中進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)和GRP78 mRNA表達(dá)水平的計(jì)算。

1.6 Western blot檢測(cè)BXPC-3細(xì)胞中GRP78蛋白的表達(dá)

分別提取未轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染GRP78-siRNA組、轉(zhuǎn)染pNeg-siRNA組細(xì)胞總蛋白進(jìn)行Western Blot檢測(cè)，SDS-PAGE分離膠濃度水平為12%，積層膠濃度水平為5%，上樣量為15 μg/L；SDS電泳條件為恒流，每塊板20～40 mA，電泳時(shí)間約為2 h；轉(zhuǎn)膜條件為恒流，每張膜42 mA，時(shí)間為3.5 h。

1.7 用SRB法檢測(cè)GRP78 shRNAs對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用

未轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染GRP78-siRNA組、轉(zhuǎn)染pNegsiRNA組細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期后，消化傳代并按1×104個(gè)細(xì)胞/孔加至96孔板，繼續(xù)分別培養(yǎng)24 h，48 h，72 h，于540 nm處用酶標(biāo)儀測(cè)光密度值(OD值)。各給藥組與對(duì)照組間以t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期變化

細(xì)胞用0.25%胰酶消化，加入冰冷的磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)將細(xì)胞輕輕吹打成單個(gè)細(xì)胞，與漂浮細(xì)胞合并(如果測(cè)凋亡細(xì)胞)；采用Fc-2518r高速冷凍離心機(jī)(安徽科大創(chuàng)新股份有限公司)，5000 r/min，離心5 min；PBS洗2遍，使用約500 μl的PBS重懸細(xì)胞邊振蕩邊加入5 ml預(yù)冷的70%乙醇，于4 ℃固定過夜。染色前細(xì)胞用PBS洗2遍，沉淀重懸于碘化丙啶(propidium iodide，PI)染液中(50 μg/ml PI＋200μg/ml RNase A，37 ℃避光染色30 min。細(xì)胞經(jīng)200目尼龍網(wǎng)過濾后用流式細(xì)胞儀測(cè)定DNA含量并分析細(xì)胞周期變化。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差及t檢驗(yàn)分析，所得計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GRP78在胰腺癌中的表達(dá)

所有標(biāo)本GRP78的陽性表達(dá)定位于細(xì)胞漿，胰腺癌的陽性表達(dá)率為88.2%(82/93)，而胰腺良性病變組織的表達(dá)率為41.4%(24/58)，正常胰腺組織表達(dá)率為10.8%(4/37)。惡性組織的免疫染色強(qiáng)度顯著強(qiáng)于良性組織。將正常胰腺組織，胰腺良性病變組織及胰腺癌組織呈現(xiàn)在一張切片上，GRP78胞漿陽性表達(dá)按正常胰腺組織，胰腺良性病變組織及胰腺癌組織順序依次增強(qiáng)(如圖1所示)。

圖1 GRP78在胰腺組織中的表達(dá)(×200)

2.2 胰腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染GRP78 shRNA后GRP78表達(dá)變化情況

GRP78 shRNA轉(zhuǎn)染后24 h、48 h、72 h收集細(xì)胞，west blot分別檢測(cè)GRP78蛋白的表達(dá)，反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-RCR)檢測(cè)GRP78 mRNA結(jié)果表明，GRP78蛋白及mRNA在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)均明顯低于未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染pNeg-siRNA組，而且下調(diào)效率在轉(zhuǎn)染72 h時(shí)最高(如圖2所示)，Bandscan軟件掃描蛋白條帶灰度值后，統(tǒng)計(jì)分析組間差異具有顯著性(t=21.64，P＜0.05)。

熒光定量PCR結(jié)果表明，GRP78 shRNA轉(zhuǎn)染后，胰腺癌BXPC-3細(xì)胞內(nèi)GRP78 mRNA表達(dá)減少，并隨轉(zhuǎn)染時(shí)間增加而表達(dá)降低程度越高；與對(duì)照組相比，各時(shí)間組GRP78 mRNA表達(dá)減少差異有顯著性意義(t=18.72，P＜0.05)，不同處理時(shí)間相比較，轉(zhuǎn)染24 h時(shí)與轉(zhuǎn)染48 h時(shí)差異無顯著性，轉(zhuǎn)染48 h時(shí)與轉(zhuǎn)染72 h時(shí)差異無顯著性，而轉(zhuǎn)染24 h時(shí)與轉(zhuǎn)染72 h時(shí)差異有顯著性意義(t=21.35，P＜0.05)，而未轉(zhuǎn)染組與轉(zhuǎn)染pNeg-siRNA組比較表達(dá)無明顯變化(見表1)。

2.3 Annexin V-FITC/PI染色結(jié)果

利用Annexin V-FITC/PI雙染色檢測(cè)BXPC-3細(xì)胞凋亡情況。在sh GRP78轉(zhuǎn)染細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)大量的早期凋亡細(xì)胞，而未轉(zhuǎn)染組與轉(zhuǎn)染pNeg-siRNA組凋亡細(xì)胞明顯不多。結(jié)果表明，抑制GRP78表達(dá)后提高了BXPC-3細(xì)胞早期自我凋亡率(如圖3所示)。

圖2 west blot檢測(cè)GRP78蛋白變化情況

圖3 Annexin V-FITC/PI雙染色檢測(cè)BXPC-3細(xì)胞凋亡情況

Annexin V-FITC/PI雙染色后采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)shRNA-GRP78 BXPC-3細(xì)胞中的凋亡細(xì)胞數(shù)。轉(zhuǎn)染GRP78-siRNA組BXPC-3細(xì)胞的凋亡率峰值達(dá)到91%，與轉(zhuǎn)染pNeg-siRNA組細(xì)胞比差異有顯著意義(t=38.75，P＜0.01)。

2.4 GRP78表達(dá)受抑對(duì)BXPC-3細(xì)胞增殖的影響

使用SRB法檢測(cè)BXPC-3細(xì)胞的增殖情況。結(jié)果顯示，與未轉(zhuǎn)染組比較轉(zhuǎn)染GRP78-siRNA組BXPC-3細(xì)胞增殖受到明顯抑制，表明GRP78促進(jìn)胰腺癌中腫瘤細(xì)胞增殖(如圖4所示)。

表1 GRP78 shRNA轉(zhuǎn)染后GRP78/β-actin表達(dá)相對(duì)值

圖4 shRNA GRP78對(duì)BXPC-3細(xì)胞增殖的影響

3 討論

胰腺癌是惡性程度很高的消化道腫瘤，發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。由于受胰腺解剖學(xué)和胰腺癌生物學(xué)特征等因素影響，胰腺癌易侵犯周圍組織器官和發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，早期診斷十分困難，70%～90%的患者確診時(shí)已喪失手術(shù)時(shí)機(jī)；即使臨床可切除胰腺癌，預(yù)后仍很差，5年生存率僅為1%～4%[5]。因此，尋找一種經(jīng)濟(jì)實(shí)惠、具有特異性、且敏感性強(qiáng)及適合于大量人口普查的早期診斷胰腺癌的手段是提高人民健康水平的重大需求。21世紀(jì)以來，分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展迅速，許多與胰腺癌發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及侵襲有關(guān)的分子生物學(xué)指標(biāo)被研究者們不斷發(fā)現(xiàn)，并尋找能為胰腺癌的人群篩查提供可靠證據(jù)的特異、敏感的分子生物學(xué)指標(biāo)[6]。

細(xì)胞在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)下會(huì)產(chǎn)生一種應(yīng)激蛋白，即GRP78，屬于熱休克蛋白家族，當(dāng)細(xì)胞處于低糖、缺氧等應(yīng)激狀態(tài)時(shí)GRP78的表達(dá)量明顯升高；在蛋白質(zhì)的折疊、裝配和運(yùn)輸過程中GRP78起著協(xié)助作用，GRP78通過非共價(jià)鍵形式瞬時(shí)與新生結(jié)合促進(jìn)蛋白質(zhì)的正確折疊和裝配，阻止錯(cuò)誤聚集的蛋白損傷機(jī)體。目前，許多研究證實(shí)，在多種人類腫瘤中GRP78呈過表達(dá)狀態(tài)。Gazit等[7]在1999年發(fā)現(xiàn)乳腺癌細(xì)胞株中GRP78表達(dá)比正常上皮細(xì)胞株的表達(dá)量高2～3倍作用；在人類非小細(xì)胞肺癌中，Merrick[8]的研究報(bào)道認(rèn)為GRP78高表達(dá)；Jiang等[9]在黑色素瘤細(xì)胞中研用siRNA阻斷GRP78表達(dá)，結(jié)果內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的Caspase-4激活和細(xì)胞凋亡水平明顯上升。

本研究探討了GRP78在人胰腺癌標(biāo)本、胰腺良性病變標(biāo)本及正常胰腺組織中的表達(dá)情況。結(jié)果表明，GRP78不論是蛋白還是mRNA水平在所有標(biāo)本中或多或少的表達(dá)。而免疫組化結(jié)果表明，GRP78在胰腺癌組織中的表達(dá)顯著加強(qiáng)，GRP78在正常組織，胰腺良性病變組織及癌組織中的表達(dá)程度依次升高。GRP78的過表達(dá)在胰腺癌新生組織生產(chǎn)及發(fā)展過程中起著重要作用，GRP78可能是組織惡性轉(zhuǎn)化的一個(gè)潛在標(biāo)記物。

目前，GRP78在各種類型腫瘤組織中過表達(dá)的機(jī)制仍然不清楚。有研究表明，GRP78高表達(dá)的一個(gè)可能原因是非折疊蛋白反應(yīng)(unfolding protein response，UPR)的結(jié)果，除了UPR外，包括PKC、PKA、Akt及ERK等在內(nèi)的信號(hào)途徑激活也誘導(dǎo)了GRP78的表達(dá)[10]。為了進(jìn)一步闡述GRP78在胰腺癌中過表達(dá)的機(jī)制及意義，本研究設(shè)計(jì)了針對(duì)抑制GRP78的sh RNA序列，構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)GRP78 shRNA的胰腺癌細(xì)胞株BXPC-3。本研究為進(jìn)一步研究GRP78在胰腺癌中表達(dá)的意義及機(jī)制提供了一定的實(shí)驗(yàn)工具及理論基礎(chǔ)。研究結(jié)果表明，穩(wěn)定表達(dá)shRNA-GRP78質(zhì)粒的BXPC-3細(xì)胞無論是在蛋白還是mRNA水平，GRP78的表達(dá)水平均受到顯著抑制。shRNA GRP78抑制GRP78在BXPC-3細(xì)胞中的表達(dá)后，BXPC-3細(xì)胞的增殖受到顯著抑制，而且BXPC-3細(xì)胞的凋亡率顯著升高，其結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了GRP78的抗凋亡功能以及GRP78在促進(jìn)腫瘤發(fā)展過程中起著重要作用。研究報(bào)道及本研究結(jié)果均表明，GRP78蛋白在控制腫瘤細(xì)胞增殖及凋亡細(xì)胞死亡的過程中起著重要作用。GRP78是腫瘤基因治療的一個(gè)潛在靶點(diǎn)。

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Study on the expression of GRP78 protein in pancreatic cancer and the effect of GRP78 onthe proliferation and apoptosis of pancreatic cancer cells/DU Jin-bing, LI Qing-hua

// China Medical Equipment,2014,11(8):47-51.

Objective: To detect the expression of GRP78 in Pancreatic Cancer, Normal pancreatic tissue and Pancreatic benign lesion tissues. Methods: The expression of GRP78 Protein in 93 cases of Pancreatic Cancer, 58 cases of Pancreatic benign lesion tissues and 37 cases of Normal pancreatic tissue were detected by using immunohistochemistry. Sh GRP78 and sh Neg based on GRP78 gene sequence were transfected respectively into human Pancreatic Cancer cell BXPC-3 using LipofectAMINE2000, then selected the positive clones by G418, detected GRP78 mRNA expression by semiquantitative RT-PCR, detected its protein steady expression by Western blot. The proliferation and apoptosis of three groups cells were detected by SRB and flow cytometer. Results: In Normal pancreatic tissue, Pancreatic benign lesion tissues and Pancreatic Cancer tissues, the positivity of GRP78 is10.8%, 41.4%, 88.2% respectively. The difference among three groups is significantly. Established stable transected cell line: BXPC-3 sh GRP78, BXPC-3 sh Neg. The expression inhibitive rates of GRP78 gene mRNA and protein in BXPC-3 Sh GRP78 were inhibited significantly. The proliferation of BXPC-3 cells were inhibited and The apoptosis of BXPC-3 cells were enhanced when the expression of GPR78 were inhibited. Conclusion: GRP78 is gradually over expressed along the normal tissue–adenoma–carcinoma sequence and that its expression may be an indicator for malignant transformation.

Glucose regulatedprotein78; Pancreatic cancer; Proliferation; Apoptosis

1672-8270(2014)08-0047-05

R735.9

A

10.3969/J.ISSN.1672-8270.2014.08.015

2014-02-20

①廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院醫(yī)務(wù)部 湖北 武漢 430070

杜進(jìn)兵，男，(1974- )，本科學(xué)歷，主治醫(yī)師。廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院醫(yī)務(wù)部，從事醫(yī)學(xué)管理工作。