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    熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)在激光共聚焦顯微鏡中的應(yīng)用

    2014-01-30 11:08:48肖忠新張進(jìn)祿
    中國醫(yī)學(xué)裝備 2014年8期
    關(guān)鍵詞:能量轉(zhuǎn)移供體熒光

    肖忠新 張進(jìn)祿*

    目前,有許多蛋白與蛋白相互作用的研究方法,如親和層析、免疫共沉淀、凝膠阻滯法、熒光光譜法及酵母雙雜交等,而熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer,F(xiàn)RET)方法可在多種細(xì)胞類型中定量研究蛋白-蛋白相互作用,具有其他方法不可比擬的優(yōu)點,在近年來廣受推崇[1]。20世紀(jì)30年代,法國物理學(xué)家Jean Perrin對FRET現(xiàn)象進(jìn)行了描述,后由德國科學(xué)家Theodor[2]和F?rster[3]闡明,從1992年綠色熒光蛋白克隆成功后,F(xiàn)RET逐漸成為研究活細(xì)胞中分子之間相互作用的強(qiáng)有力的技術(shù)方法[4]。

    1 FRET基本原理

    FRET是指兩個熒光基團(tuán)間能量通過偶極-偶極耦合作用以非輻射方式從供體傳遞給受體的現(xiàn)象,應(yīng)用能量轉(zhuǎn)移來測量分子內(nèi)和分子間的距離。FRET技術(shù)可在單個固定細(xì)胞或活細(xì)胞原位生理環(huán)境下檢測分子間的直接相互作用,如檢測配體-受體、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)折疊以及蛋白質(zhì)二聚化等。21世紀(jì)初,F(xiàn)RET現(xiàn)象已可利用3種方式進(jìn)行研究,即光學(xué)強(qiáng)度成像測量、光譜測量和壽命測量[5]。

    FRET的效率(E)與供體-受體間距離(r)的6次方成反比,即其中R0是E=50%時的供體-受體距離,稱為F?rster距離或臨界轉(zhuǎn)移距離。FRET的發(fā)生需滿足4個條件:供體-受體間距離≤10 nm;供體的發(fā)射光譜與受體的激發(fā)光譜有一定重疊;供體-受體偶極矩具有合適的相對取向;供體量子產(chǎn)率和受體光吸收系數(shù)足夠高[6]。

    2 FRET的測定方法

    用激光共聚焦顯微鏡檢測FRET具有獨特的優(yōu)勢,利用其激光光源激發(fā)供體、多通道同時檢測雙重(或多重)熒光信號,并利用時間掃描程序檢測熒光信號在二維及三維空間的變化,且還可利用其軟件可得出定量測定曲線和數(shù)據(jù)[7]。利用激光共聚焦顯微鏡研究FRET有兩類常用方法:即敏化發(fā)射和受體光漂白測量方法。

    2.1 敏化發(fā)射方法

    敏化發(fā)射測量方法其原理是在激發(fā)供體的情況下檢測受體發(fā)射熒光的強(qiáng)度,其為FRET成像中簡單直觀的一種方法,適用于活細(xì)胞及熒光蛋白轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。實驗前需構(gòu)建熒光融合蛋白的重組載體,經(jīng)酶切與測序鑒定正確后再進(jìn)行共轉(zhuǎn)染細(xì)胞,在其轉(zhuǎn)染效率達(dá)到30%左右時進(jìn)行測定[8]。在敏化發(fā)射方法中應(yīng)注意兩種干擾因素:①Bleed through,激發(fā)供體的同時受體受到激發(fā)而發(fā)光,激發(fā)受體的同時供體受到激發(fā);②Cross-talk,激發(fā)供體時在受體通路檢測到供體的發(fā)射光,激發(fā)受體時在供體通道檢測到受體的發(fā)射光??赏ㄟ^計算各個通道內(nèi)的串?dāng)_因子系數(shù),將總FRET信號按照系數(shù)減去一定比例的串?dāng)_因子,得到FRET效率。目前,有許多推薦的方法具體指導(dǎo)串?dāng)_因子的扣除[8]。

    在實驗中,除了測量待測FRET樣本實驗外,還需增加3個參考樣本對系統(tǒng)進(jìn)行串?dāng)_校正,即供體熒光團(tuán)的供體對照樣本、受體熒光團(tuán)的受體對照樣本和已知FRET效率的校正樣本[9-10]。敏化發(fā)射方法也有其自身的限制,需要利用對照樣本對光學(xué)檢測系統(tǒng)以及熒光基團(tuán)的光學(xué)性質(zhì)進(jìn)行事先校正,增加了實驗的工作量和難度[11]。敏化發(fā)射方法適于檢測固定細(xì)胞、活細(xì)胞和熒光蛋白轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。在實驗中需注意,應(yīng)去除光譜交叉和本底的影響,檢測過程較繁瑣,對樣品要求較高(需要有雙轉(zhuǎn)、單轉(zhuǎn)供體,單轉(zhuǎn)受體樣本)。

    2.2 受體光漂白方法

    受體漂白FRET(acceptor photobleaching FRET,apFRET)是一種檢測FRET的方法,其基本原理是,如果2個熒光分子存在能量轉(zhuǎn)移,對受體進(jìn)行光漂白后其供體的熒光就會升高。通過檢測供體熒光的增強(qiáng)來計算FRET效率,F(xiàn)RET效率以供體熒光增強(qiáng)的百分?jǐn)?shù)表示(公式1):

    式中I和I′分別為漂白前和漂白后的供體的熒光強(qiáng)度[12]。

    在共聚焦顯微鏡上容易實現(xiàn)受體光漂白方法操作,測量FRET效率既不依賴于系統(tǒng)參數(shù),也不依賴于供體與受體的量子產(chǎn)率和消光系數(shù),只依賴于受體光漂白前后供體的熒光強(qiáng)度變化。然而,受體光漂白會對生物體造成的損傷,不利于在單細(xì)胞中進(jìn)行多次測量,也不能在細(xì)胞中進(jìn)行實時動態(tài)檢測[11]。

    受體光漂白方法適于固定及免疫熒光標(biāo)記的樣品,其優(yōu)點是可完全克服“bleed through”,“Crosstalk”(光譜滲透干擾),因此不需要進(jìn)行復(fù)雜校正,測量比較簡便,容易獲得實驗結(jié)果;其缺點是因測量時需對受體熒光分子進(jìn)行光漂白,如果樣品是活細(xì)胞,在光漂白的過程中,被檢測的分子會發(fā)生改變,所以只適合檢測固定樣品細(xì)胞內(nèi)分子間相互作用。

    3 FRET技術(shù)在實驗中的應(yīng)用

    3.1 FRET熒光對的選擇

    在FRET體系中常用的熒光能量供體、受體對主要有CFP/YFP、BFP/GFP、GFP/RFP和CY3/CY5等[13-15]。目前,F(xiàn)RET技術(shù)需解決的問題是如何減少和排除非特異信號,提高對極低水平信號的探測[16]。而構(gòu)建一個高效、特異的FRET探針并非易事,在研制熒光蛋白FRET探針過程中所面臨的主要問題則在于如何提高探針在活細(xì)胞中檢測的特異性和敏感性[17]。

    選擇FRET熒光對應(yīng)遵循的原則:①供體的熒光量子產(chǎn)率(QD)要大;②供體和受體的光譜重疊積分J(λ)應(yīng)盡可能大,即供體發(fā)射光譜與受體激發(fā)光譜應(yīng)盡可能多的重疊(>30%);③供體和受體之間光譜干擾(cross-talk)要盡量??;④有較高的信噪比(S/B);⑤能量供體受體對要有適度的光漂白性質(zhì),從而有利于用不同的方法檢測FRET[18]。

    由于在分子之間發(fā)生FRET的距離<10 nm,F(xiàn)RET適合檢測較小的蛋白質(zhì)的相互作用[19-21]。

    3.2 FRET技術(shù)的局限性

    FRET技術(shù)受客觀因素影響較多,如待測分子濃度、光漂白及激發(fā)光強(qiáng)度等,因此其重復(fù)性不夠好。用FRET檢測蛋白有相互作用,要求有較高的轉(zhuǎn)染效率設(shè)置對照等要求。目前,分析蛋白質(zhì)間的相互作用需要結(jié)合兩種不同的方法相互取長補短才能得出一個科學(xué)的結(jié)論,通過結(jié)合FRET技術(shù)和免疫共沉淀技術(shù)能達(dá)到較理想的狀態(tài)[22]。

    3.3 FRET技術(shù)的應(yīng)用范圍

    FRET的技術(shù)可用于檢測酶活性變化、細(xì)胞凋亡的研究以及膜蛋白的研究[23]。激光共聚焦顯微鏡已成熟應(yīng)用于原位鑒定細(xì)胞或組織內(nèi)生物大分子,觀察細(xì)胞及亞細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)等領(lǐng)域,許多有關(guān)蛋白分子的共定位、蛋白分子聚合體、轉(zhuǎn)錄機(jī)制和蛋白折疊等分子生物學(xué)問題均可通過FRET技術(shù)得到解決[24]。

    4 FRET技術(shù)發(fā)展趨勢

    在發(fā)光源、高級成像技術(shù)和理論分析模型等領(lǐng)域的創(chuàng)新推動了FRET技術(shù)的發(fā)展,以稀土發(fā)光材料作為供體的共振能量傳遞(luminescence resonance energy transfer,LRET)以及基于能量供體和能量受體之間非放射性的能量轉(zhuǎn)移的生物發(fā)光能量轉(zhuǎn)移(bioluminescence resonance energy transfer,BRET)的研究方法也相繼出現(xiàn)。今后隨著各領(lǐng)域方法技術(shù)的日益交匯融合,以及新儀器的層出涌現(xiàn),生命科學(xué)的分析測試能力將不斷增強(qiáng),為生命科學(xué)研究提供日益精尖的工具[16]。如FRET技術(shù)和熒光相關(guān)譜(fluorescence correlation spectroscopy,F(xiàn)CS)技術(shù)是兩種可在活細(xì)胞中檢測單分子行為的互補技術(shù),F(xiàn)RET技術(shù)反映分子自身構(gòu)像變化和分子間的空間距離變化,而FCS技術(shù)從分子熒光漲落中提取單分子的動態(tài)行為如濃度和擴(kuò)散系數(shù)[25]。

    綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)及其變種的發(fā)現(xiàn)以及顯微熒光技術(shù)的發(fā)展使得FRET技術(shù)在活細(xì)胞中的應(yīng)用更加廣泛[11]。熒光蛋白、有機(jī)染料以及半導(dǎo)體量子點在單分子熒光技術(shù)上均有應(yīng)用。由于其光穩(wěn)定性遠(yuǎn)強(qiáng)于熒光蛋白及有機(jī)熒光染料,半導(dǎo)體量子點作為一種新型的熒光探針正越來越廣泛地被采用[26]。未來隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,測量儀器和技術(shù)方法的不斷更新和改進(jìn),探針的改進(jìn)及數(shù)據(jù)分析的改進(jìn),F(xiàn)RET技術(shù)將有很大的發(fā)展空間,F(xiàn)RET技術(shù)必將對生命科學(xué)的發(fā)展起到重大的推動作用。

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