細(xì)葉榕樹(shù)提取物急性毒性及身體依賴性實(shí)驗(yàn)研究①

馮燕云，胡銀婷，吳廣勇，賴術(shù)

（1.右江民族醫(yī)學(xué)院影像醫(yī)學(xué)本科2010級(jí)學(xué)生，廣西 百色 533000 E－mail：bswaterair＠163.com；2.右江民族醫(yī)學(xué)院護(hù)理學(xué)本科2010級(jí)學(xué)生，廣西 百色 533000；3.右江民族醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)本科2009級(jí)學(xué)生，廣西 百色 533000；4.右江民族醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，廣西 百色 533000）

榕樹(shù)是桑科（Moraceae）榕屬（Ficus）植物的總稱，全世界有1 200多種，主要分布在熱帶、南亞熱帶地區(qū)［1］，細(xì)葉榕（F.microcarpa）為其中之一。文獻(xiàn)［2］記載，細(xì)葉榕為常用中草藥，以氣根、樹(shù)皮、葉芽入藥，具有祛風(fēng)活絡(luò)、除濕消腫、清熱解毒、抗毒消炎功效，治支氣管炎、痢疾、跌打損傷、風(fēng)濕、骨折等，以民間應(yīng)用為主。目前主要是細(xì)葉榕化學(xué)成分研究報(bào)道［3－4］，程輝等［5］報(bào)道細(xì)葉榕（葉、枝、氣根混合水提物）有一定的抗炎鎮(zhèn)痛作用，國(guó)外學(xué)者從小葉榕氣生根中分離得到多種結(jié)構(gòu)新穎的三萜類成分，并證明其具有一定的抗腫瘤活性［6］。這些研究表明細(xì)葉榕具有較好的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值，但細(xì)葉榕毒理學(xué)研究迄今尚未見(jiàn)報(bào)道。本課題對(duì)其水、醇提取物的急性毒性及身體依賴性進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用細(xì)葉榕提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物 新鮮細(xì)葉榕樹(shù)枝及樹(shù)葉、氣根，2012年8月采自右江民族醫(yī)學(xué)院院內(nèi)，經(jīng)我院韋斯軍主任中藥師鑒定。納洛酮注射液（山東新華制藥股份有限公司，批號(hào)：120526），95%乙醇溶液。

1.2 藥物制備 細(xì)葉榕水提取物：新鮮細(xì)葉榕樹(shù)枝、樹(shù)葉、氣根分別切細(xì)后水提?。ㄖ蠓?h，提取3次，過(guò)濾，合并濾液），加熱濃縮至每1 ml溶液相當(dāng)于5g生藥。細(xì)葉榕醇提取物：用95%乙醇浸泡24h，濾液采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮，揮發(fā)至無(wú)乙醇味（檢測(cè)不含乙醇），配成每1ml溶液相當(dāng)于5g生藥。實(shí)驗(yàn)時(shí)水、醇提物溶液濃度為1ml溶液相當(dāng)于5g生藥，能通過(guò)小鼠灌胃針頭。

1.3 動(dòng)物 清潔級(jí)昆明種小鼠210只，體質(zhì)量（20±2）g，雌雄各半。動(dòng)物及飼料均由右江民族醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)為：SCXK 桂2012－003。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 預(yù)實(shí)驗(yàn) 在進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)之前，進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，為正式實(shí)驗(yàn)提供依據(jù)。將70 只小鼠隨機(jī)分為7 組，每組10 只，雌雄各半，灌胃前禁食不禁水16h。給藥組：以小鼠灌胃可承受的最大體積（每10g體質(zhì)量0.4ml）1次灌胃給細(xì)葉榕水、醇提取物（共6組：細(xì)葉榕葉水及醇提取物、細(xì)葉榕枝水及醇提取物、細(xì)葉榕氣根水及醇提取物），給藥后常規(guī)飼養(yǎng)，觀察3d。生理鹽水對(duì)照組灌胃給予等量蒸餾水，方法同給藥組。結(jié)果小鼠全部存活，因此，無(wú)法測(cè)出細(xì)葉榕提取物的LD50，提示各提取物毒性很低，是較安全的，故測(cè)定細(xì)葉榕水、醇提取物對(duì)小鼠的最大耐受量［7］。

1.4.2 最大耐受量測(cè)定［7］取小鼠70只，體質(zhì)量（20±2）g，雌雄各半，隨機(jī)分為給藥組（共6 組：細(xì)葉榕葉水及醇提取物、細(xì)葉榕枝水及醇提取物、細(xì)葉榕氣根水及醇提取物）和生理鹽水對(duì)照組，每組10只。于禁食不禁水16h后灌胃給受試藥物。給藥組，每次每只小鼠按0.4ml／10g 分別灌胃給予細(xì)葉榕水、醇提取物，共給藥2 次（間隔8h），每次用藥劑量為200g／kg（生藥），2次總劑量為400g／kg（生藥）；生理鹽水對(duì)照組，每次每只小鼠灌胃給予蒸餾水相同容積生理鹽水，共給藥2次（間隔8h）［8］，飼料喂養(yǎng)，自由飲水。

給藥前稱重，給藥后立即觀察動(dòng)物反應(yīng)情況，第1日觀察3次，以后每日觀察2次，連續(xù)觀察14d，記錄動(dòng)物皮膚、毛色、呼吸、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、自主行為等，每隔兩天稱重一次。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)對(duì)小鼠進(jìn)行尸檢，解剖觀察其心、肝、脾、肺、腎等主要器官的組織變化。

1.4.3 小鼠催促戒斷試驗(yàn)［9］取小鼠70 只，雌雄各半，隨機(jī)分為給藥組（共6組：細(xì)葉榕葉水及醇提取物、細(xì)葉榕枝水及醇提取物、細(xì)葉榕氣根水及醇提取物）和生理鹽水對(duì)照組，每組10只。細(xì)葉榕提取物組采用遞增給藥法（按0.2ml／10g，0.3ml／10g，0.4 ml／10g 遞增給藥）每日灌胃給藥2 次（9：00，17：00），連續(xù)給藥9d?？瞻讓?duì)照組每天灌胃同容積的生理鹽水。第10d僅在上午9：00給藥1次，末次給藥2h后給予納洛酮（4 mg·kg－1，皮下注射）催促。觀察60min內(nèi)各組小鼠跳躍次數(shù)及催促前后體重變化情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以（±s）表示，各組均數(shù)間比較采用t檢驗(yàn)。P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 毒性反應(yīng)情況 第1次給藥后，立即觀察，給藥組小鼠在給藥后4h內(nèi)未出現(xiàn)叫聲異常、震顫、驚厥、運(yùn)動(dòng)失調(diào)、流涎、呼吸困難、腹瀉等現(xiàn)象；第2 次給藥后給藥組小鼠表現(xiàn)同上。對(duì)照組小鼠灌胃給予蒸餾水后無(wú)異常反應(yīng)；繼續(xù)觀察14d，每天觀察2次（08：00和20：00）。在觀察的14d中兩組小鼠均未出現(xiàn)叫聲異常、震顫、驚厥、運(yùn)動(dòng)失調(diào)、流涎、呼吸困難、腹瀉等現(xiàn)象，給藥14d內(nèi)小鼠未出現(xiàn)死亡情況。

2.2 給藥前后體重變化情況 停藥后各給藥組小鼠的體重均正常逐漸增加，并且增加幅度與生理鹽水對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1。說(shuō)明細(xì)葉榕水及醇提取物急性毒性反應(yīng)不明顯。

表1 細(xì)葉榕水、醇提取物小鼠急性毒性試驗(yàn)給藥前后動(dòng)物體重變化 （±s，g）

表1 細(xì)葉榕水、醇提取物小鼠急性毒性試驗(yàn)給藥前后動(dòng)物體重變化 （±s，g）

組別 n 給藥前 給藥后第3d 給藥后第6d 給藥后第10d 給藥后第14d細(xì)葉榕葉水提取物組 10 26.62±2.73 28.08±2.74 30.09±2.66 31.79±2.14 33.72±1.78細(xì)葉榕葉醇提取物組 10 26.50±2.21 28.27±2.86 30.65±2.74 32.43±2.37 34.14±1.95細(xì)葉榕枝水提取物組 10 27.25±2.81 30.51±3.06 32.22±2.75 33.79±2.31 35.21±2.19細(xì)葉榕枝醇提取物組 10 25.50±3.08 28.99±3.88 30.50±3.77 32.30±3.11 34.27±2.37細(xì)葉榕氣根水提取物組 10 25.39±2.16 27.87±2.84 29.91±2.80 31.66±2.41 33.52±1.97細(xì)葉榕氣根水提取物組 10 26.27±1.91 28.35±2.67 30.45±2.41 32.35±2.19 34.07±1.82細(xì)葉榕生理鹽水對(duì)照組 10 25.26±2.44 28.57±2.87 30.71±2.76 32.49±2.28 34.46±1.92

2.3 內(nèi)臟結(jié)構(gòu)觀察 實(shí)驗(yàn)第14d稱重小鼠后逐只處死并解剖，肉眼觀察肝、脾、肺、腎、腎上腺、胸腺、卵巢、子宮、精囊、前列腺、睪丸、胃、腸及胸腔、腹腔，各器官均未出現(xiàn)體積、顏色、質(zhì)地明顯改變，說(shuō)明細(xì)葉榕水及醇提取物急性毒性反應(yīng)不明顯。

2.4 小鼠催促戒斷試驗(yàn)結(jié)果 實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，用納洛酮催促后各組小鼠均無(wú)跳躍反應(yīng)，催促前后體重平均變化率與與生理鹽水對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均＞0.05），見(jiàn)表2。說(shuō)明細(xì)葉榕水及醇提取物本身無(wú)身體依賴性。

表2 小鼠催促戒斷試驗(yàn)結(jié)果 （±s）

表2 小鼠催促戒斷試驗(yàn)結(jié)果 （±s）

注：與生理鹽水對(duì)照組比較，a：t＝1.17，b：t＝1.15，c：t＝1.70，d：t＝0.19，e：t＝0.11，f：t＝1.44，P 均＞0.05

組別 n 跳躍鼠數(shù) 跳躍次數(shù) 體重變化百分率細(xì)葉榕葉水提取物組 10 0 0－2.83±1.51 a細(xì)葉榕葉醇提取物組 10 0 0－1.36±1.90b細(xì)葉榕枝水提取物組 10 0 0－1.23±1.35c細(xì)葉榕枝醇提取物組 10 0 0－2.05±1.32d細(xì)葉榕氣根水提取物組 10 0 0－2.20±0.99e細(xì)葉榕氣根醇提取物組 10 0 0－1.41±1.24f 10 0 0－2.15±1.04細(xì)葉榕生理鹽水對(duì)照組

3 討論

以小鼠灌胃可承受的最大體積（每10g體質(zhì)量0.4ml）1次灌給細(xì)葉榕水、醇提取物，給藥后常規(guī)飼養(yǎng)，觀察3d，結(jié)果小鼠全部存活，因此，無(wú)法測(cè)出細(xì)葉榕提取物的LD50。最大耐受量實(shí)驗(yàn)中細(xì)葉榕水、醇提取物每次用藥劑量為400g／kg（生藥），2次總劑量為800g／kg（生藥），停藥后各給藥組小鼠的體重均正常逐漸增加，并且增加幅度與生理鹽水對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，亦未見(jiàn)實(shí)驗(yàn)小鼠有毒性反應(yīng)，肉眼觀察主要器官均未見(jiàn)明顯異常，提示細(xì)葉榕水、醇提取物毒性低，安全性較高。納洛酮催促后各組小鼠均無(wú)跳躍反應(yīng)，催促前后體重平均變化率與與生理鹽水對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均＞0.05），即納洛酮不能引發(fā)細(xì)葉榕水、醇提取物組小鼠的戒斷癥狀，提示細(xì)葉榕水、醇提取物本身無(wú)身體依賴性，即無(wú)成癮性。初步研究表明細(xì)葉榕具有很好的開(kāi)發(fā)利用前景。

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