藥用植物內(nèi)生菌對(duì)青藤堿的微生物轉(zhuǎn)化篩選

劉發(fā)貴，潘 燁，鄧艾平，羅 丹，楊 進(jìn)，郭志勇，鄧張雙

三峽大學(xué) 天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，宜昌 443002

青藤堿(Sinomenine)是一種天然嗎啡烷類生物堿，擁有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、降血壓、促組胺釋放、神經(jīng)保護(hù)等多種藥理活性，臨床用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的輔助治療［1］。但是，青藤堿分子結(jié)構(gòu)對(duì)光、熱、堿不穩(wěn)定，且生物利用度低，易引起腸胃不適等副作用，限制了青藤堿作為抗炎藥物的應(yīng)用［2］。為了克服這些缺陷，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)青藤堿分子進(jìn)行了化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾，卻很少發(fā)現(xiàn)抗炎活性突出的青藤堿衍生物［3］。生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)具有反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)產(chǎn)物立體選擇性好、較易獲得結(jié)構(gòu)新穎的化合物等特點(diǎn);同時(shí)符合生物體代謝規(guī)律，發(fā)現(xiàn)具有生理活性的代謝產(chǎn)物幾率高［4］。

關(guān)于青藤堿的生物轉(zhuǎn)化研究國(guó)內(nèi)外報(bào)道較少。陳磊［5］報(bào)道了真菌Cunninghamella M2 轉(zhuǎn)化青藤堿為羥基青藤堿，但是沒有給出轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)式。課題組在前期研究過程中，發(fā)現(xiàn)真菌Antrodiella semisupina 能催化青藤堿和愈創(chuàng)木酚形成碳碳和碳氧交叉偶聯(lián)產(chǎn)物1 和2［6］，且能選擇性的催化青藤堿及類似物轉(zhuǎn)化為(S)-雙青藤堿類結(jié)構(gòu)3 和4［6-8］。Joyeau Roger 等［9］人發(fā)現(xiàn)青藤堿衍生物O-benzyl-sinomenine 能被真菌Mucor plumbeus ATCC 4740 轉(zhuǎn)化成去氮甲基產(chǎn)物5 和氮氧化物6 兩種轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。課題組借鑒前期研究經(jīng)驗(yàn)，繼續(xù)研究青藤堿的微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)及轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，本文以藥用植物內(nèi)生菌為研究載體，建立青藤堿的微生物轉(zhuǎn)化篩選模型，研究青藤堿與內(nèi)生菌共培養(yǎng)以后的代謝產(chǎn)物，以期發(fā)現(xiàn)具有高效抗炎效果或者結(jié)構(gòu)新穎的青藤堿衍生物。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

青藤堿鹽酸鹽:購(gòu)自成都鉅龍?zhí)烊凰帢I(yè)生命科技有限公司，經(jīng)HPLC 分析，純度≥97.0%。GF254薄層層析硅膠板(20 mm × 20 mm，0.25 mm)和正相硅膠(300～400 目)均購(gòu)自青島海洋化學(xué)有限公司。薄層層析條件:CHCl3-CH3OH(9∶1，V/V)，254 nm 紫外顯色。分析試劑均為色譜純，常規(guī)試劑均為分析純。

圖1 青藤堿微生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物Fig.1 Chemical structures of sinomenine and its biotransformed products

1.2 儀器

1H NMR、13C NMR、1H-1H COSY、HMQC 和HMBC 譜由Bruker Avance III-400 核磁共振儀測(cè)得，溶劑為CDCl3，內(nèi)標(biāo)為四甲基硅烷(Tetramethylsilane，TMS)，化學(xué)位移記為δ(ppm);化合物分子量由液相色譜-雙重漏斗傳輸離子阱質(zhì)譜儀(儀器型號(hào)為AmozonSL+1200，布魯克.道爾頓公司)測(cè)得;微生物培養(yǎng)在恒溫?fù)u床HQD150LB(武漢海聲達(dá)儀器設(shè)備有限公司)上進(jìn)行。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 植物組織

采自湖北省神龍架林區(qū)，分別為青風(fēng)藤［Sinomenium acutum(Thunb)Rehd.et Wils.］、夾竹桃(Nerium oleander)、朵 云(Botrychium daucifoltum Woll)、蛇菰(Balanophora japonica)，由三峽大學(xué)天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室楊進(jìn)副教授鑒定。

2.2 斜面培養(yǎng)基(SPM)

將200 g 去皮土豆切成小塊，加適量水煮沸30 min，用紗布過濾，濾液中加入瓊脂30 g，煮沸，加入葡萄糖20 g，KH2PO43.0 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，微量維生素B1，調(diào)節(jié)pH 至6.0，定容至1 L，用試管分裝(約10 mL/1 支試管)，在121 ℃下滅菌20 min。

2.3 微生物轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基(SPM)

將200 g 去皮土豆切成小塊，加適量水煮沸30 min，用紗布過濾，濾液中加入葡萄糖20 g，KH2PO43.0 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，微量維生素B1，調(diào)節(jié)pH 至6.0，定容至1 L，用250 mL 錐形瓶分裝(約100 mL/1 個(gè)錐形瓶)，在121 ℃下滅菌20 min。

2.4 菌株分離

取部分植物組織放入75%左右的酒精溶液(含少量抗生素)中蕩洗，接入含抗生素的PDA 平板中，倒置培養(yǎng)，觀察并做好記錄，待菌落開始萌發(fā)時(shí)，將單個(gè)菌落轉(zhuǎn)入PDA 平板上繼續(xù)培養(yǎng)、分離純化，并進(jìn)行斜面保種。

2.5 轉(zhuǎn)化菌株篩選

活化7 d 的斜面菌種，轉(zhuǎn)接到100 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基中，恒溫振蕩器上培養(yǎng)4 d(25 ℃，150 rpm)，利用無菌濾膜加入青藤堿鹽酸鹽水溶液1 mL(20 mg/mL)，同樣條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 d，停止培養(yǎng)。將發(fā)酵液過濾，濾液用NH3·H2O 調(diào)節(jié)pH 值至10.0，接著用CH2Cl2萃取(100 mL × 3)，合并萃取液，無水Na2SO4干燥，過濾，旋轉(zhuǎn)蒸干溶劑，得固體粉末。用少量CHCl3溶解，在GF254薄層層析硅膠板上以一定間距點(diǎn)樣，展開劑為CHCl3-CH3OH(9∶1，V/V)，254 nm 紫外燈下檢測(cè)，觀察紫色斑點(diǎn)位置及大小，確定是否存在轉(zhuǎn)化。同樣條件下，分別以培養(yǎng)過程中不添加青藤堿和不接入菌種作為空白對(duì)照。

2.6 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的制備

活化7 d 的斜面菌種，轉(zhuǎn)接到200 mL 的發(fā)酵培養(yǎng)基(SPM)中，恒溫振蕩器上培養(yǎng)4 d(25 ℃，150 rpm)，利用無菌濾膜加入青藤堿鹽酸鹽水溶液1 mL(20 mg/mL)，同樣條件下繼續(xù)培養(yǎng)4d，停止培養(yǎng)。將發(fā)酵液過濾，濾液用NH3·H2O 調(diào)節(jié)pH 值至10.0，接著用CH2Cl2萃取(200 mL × 3 × 10)，合并萃取液，無水Na2SO4干燥，過濾，旋轉(zhuǎn)蒸干溶劑，得固體粉末。經(jīng)硅膠層析柱、HPLC 半制備柱分離，得轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。

3 結(jié)果與分析

3.1 青藤堿生物轉(zhuǎn)化菌株的篩選

從青風(fēng)藤［Sinomenium acutum(Thunb)Rehd.et Wils.］、夾竹桃(Nerium oleander)、朵云(Botrychium daucifoltum Woll)、蛇菰(Balanophora japonica)四種植物組織中利用傳統(tǒng)的劃線分離方法共分得植物內(nèi)生菌84 株，保藏在天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室微生物菌種庫(kù)，暫未做鑒定。采用PDY 液體發(fā)酵方式，將青藤堿與84 株菌株分別進(jìn)行共培養(yǎng)，篩選出7 株具有青藤堿轉(zhuǎn)化能力的微生物菌株，菌株編號(hào)分別為JZT01、JZT11、DY10、SD04、SD06、BY09、Q08。其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物經(jīng)薄層色譜分析(圖2)，7株菌株在青藤堿轉(zhuǎn)化能力上大致分為四種類型:(1)菌株Q08 具有完全轉(zhuǎn)化青藤堿的能力，且轉(zhuǎn)化產(chǎn)物單一，經(jīng)TLC 分析初步鑒定為(S)-disinomenine;(2)菌株JZT11 和DY10 具有完全降解青藤堿的能力，青藤堿被代謝成小分子后可能作為碳、氮源被微生物生長(zhǎng)所消耗;(3)菌株SD06、SD04 和BY09 具有部分轉(zhuǎn)化青藤堿的能力。這三株菌株與青藤堿共培養(yǎng)4 d 后，青藤堿并未完全轉(zhuǎn)化成代謝產(chǎn)物，經(jīng)TLC 分析，初步鑒定轉(zhuǎn)化產(chǎn)物均為(S)-disinomenine 和(R)-disinomenine，其中(S)-disinomenine 為主要產(chǎn)物;(4)菌株JZT01 具有較弱的青藤堿轉(zhuǎn)化能力，經(jīng)TLC 分析，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物非(S)-disinomenine 和(R)-disinomenine，可能是一種具有新結(jié)構(gòu)的代謝產(chǎn)物。但是，該菌株代謝青藤堿的酶活較低，如何通過代謝調(diào)控提高酶活力，從而加速青藤堿的轉(zhuǎn)化速度，將是課題組后續(xù)努力方向之一。

3.2 青藤堿生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的分離與結(jié)構(gòu)鑒定

圖2 青藤堿轉(zhuǎn)化產(chǎn)物薄層色譜(TLC)分析Fig.2 TLC analysis of sinomenine and its metabolites

為了進(jìn)一步確認(rèn)菌株SD06、SD04 和BY09 轉(zhuǎn)化青藤堿的產(chǎn)物為(S)-disinomenine 和(R)-disinomenine，選取菌株SD04 進(jìn)行放大培養(yǎng)，加入青藤堿鹽酸鹽總計(jì)530 mg，共獲得轉(zhuǎn)化產(chǎn)物粗提物600 mg，經(jīng)硅膠層析柱吸附，CH2Cl2-CH3OH(9∶1，V/V)淋洗，得轉(zhuǎn)化產(chǎn)物S1(250 mg，產(chǎn)率50%，按青藤堿加入量計(jì)算)，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物S2(100 mg，產(chǎn)率20%，按青藤堿加入量計(jì)算)。對(duì)菌株SD04 與青藤堿共培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物經(jīng)過系統(tǒng)分離及NMR 鑒定，確定青藤堿被真菌SD04 轉(zhuǎn)化為兩種代謝產(chǎn)物S1 和S2，分別為(S)-disinomenine 和(R)-disinomenine。

化合物S11H NMR(400 MHz，CDCl3)δ:6.27(s，1H)，6.26(brs，1H)，5.45(d，J=1.7 Hz，1H)，4.41(d，J=15.5 Hz，1H)，3.75(s，3H)，3.52(s，3H)，3.09(t，J=4.0 Hz，1H)，3.06(brs，1H)，2.56(dd，J=2.6，11.8 Hz，1H)，2.49(d，J=15.6 Hz，1H)，2.43(dd，J=5.4，18.8 Hz，1H)，2.34(s，3H)，2.33(d，J=18.8 Hz，1H)，2.19(td，J=2.8，11.9 Hz，1H)，2.03(d，J=12.3 Hz，1H)，1.93(dd，J=4.4，12.8 Hz，1H);13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ:193.9，152.4，144.8，143.7，130.5，127.7，123.2，115.0，110.6，56.2，55.9，54.7，49.2，47.1，45.7，42.9，40.8，35.8，23.8;ESI-MS m/z 657［M +H］+。NMR 數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［6］對(duì)照，鑒定化合物S1 為(S)-disinomenine。

化合物S21H NMR(400 MHz，CDCl3)δ:6.44(s，1H)，5.30(brs，1H)，4.43(d，J=15.7 Hz，1H)，3.80(s，3H)，3.52(s，3H)，3.02-2.94(m，2H)，2.60-2.42(m，3H)，2.30(s，3H)，2.12-1.96(m，2H)，1.90(td，J=4.2，12.4 Hz，1H)，1.77(dd，J=5.0，18.8 Hz，1H);13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ:193.8，152.3，145.0，143.9，130.8，128.0，123.1，114.7，109.4，56.2，56.0，54.3，49.1，47.2，45.5，43.0，40.6，35.6，22.5;ESI-MS m/z 657［M+H］+。NMR 數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［6，7］對(duì)照，鑒定化合物S2 為(R)-disinomenine。

菌株JZT01 與青藤堿共培養(yǎng)(0.15 mg/mL)5 d后得發(fā)酵液4 L，經(jīng)調(diào)堿、萃取得浸膏200 mg，硅膠層析柱分離得轉(zhuǎn)化產(chǎn)物S3(5 mg，產(chǎn)率0.8%，按青藤堿加入量計(jì)算)。

化合物S3 淡黃色，無定型粉末，分子式為C19H23NO5，分子量與青藤堿相比，增加16?；衔?H NMR 顯示化合物S3 含有22 個(gè)質(zhì)子信號(hào)(未見苯環(huán)羥基質(zhì)子信號(hào))，包括2 個(gè)偶聯(lián)的芳基質(zhì)子信號(hào)δ 6.70(d，J=8.4 Hz，1H)和δ 6.54(d，J=8.4 Hz，1H);1 個(gè)烯烴質(zhì)子信號(hào)δ 5.38(d，J=2.0 Hz，1H);2 個(gè)甲氧基質(zhì)子信號(hào)δ 3.83 (s，3H)和δ 3.49(s，3H);1 個(gè)氮甲基質(zhì)子信號(hào)δ 3.290(s，3H);聯(lián)合質(zhì)子偶聯(lián)常數(shù)及HMQC 譜可分辨4 個(gè)亞甲基質(zhì)子信號(hào)δ 1.86(d，J=13.2 Hz，1H)和δ 2.67(dd，J=4.4，13.2 Hz，1H)，δ 2.60(d，J=15.2 Hz，1H)和δ 4.37(d，J=15.2 Hz，1H)，δ 2.89(td，J=3.2，12.4 Hz，1H)和δ 3.12(dt，J=2.0，12.4 Hz，1H)，δ 3.06(d，J=19.2 Hz，1H)和δ 3.293(dd，J=5.6，19.2 Hz，1H);2 個(gè)次甲基質(zhì)子信號(hào)δ 4.39(brs，1H)和δ 3.67(t，J=4.4 Hz，1H)。13C NMR 顯示化合物S3 含有19 個(gè)碳信號(hào)，包括2 個(gè)苯環(huán)烯碳信號(hào)δ 118.5 和δ 113.1;1 個(gè)烯碳信號(hào)δ 109.9;2 個(gè)次甲基碳信號(hào)δ 73.4 和δ 38.9;3 個(gè)甲基碳信號(hào)δ 58.2、56.2 和55.0;4 個(gè)亞甲基碳信號(hào)δ 61.3、47.7、31.6 和29.1;7 個(gè)季碳信號(hào)。與青藤堿分子NMR 譜圖相比，可見9、14、16 和17 位的質(zhì)子信號(hào)和碳信號(hào)明顯移向低場(chǎng)，其他碳?xì)湫盘?hào)與青藤堿基本一致，說明在這4 個(gè)位置的中心碳原子上插入了雜原子。結(jié)合上面數(shù)據(jù)分析，可以推測(cè)在基團(tuán)NCH3的氮原子上插入了氧原子，形成了N 氧化物。NMR 數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［10］對(duì)照，鑒定化合物S3 為sinomenine N-oxide。

化合物S31H NMR(400 MHz，CDCl3)δ 6.70(d，J=8.4 Hz，1H)，6.54(d，J=8.4 Hz，1H)，5.38(d，J=2.0 Hz，1H)，4.39(brs，1H)，4.37(d，J=15.2 Hz，1H)，3.83(s，3H)，3.67(t，J=4.4 Hz，1H)，3.49(s，3H)，3.293(dd，J=5.6，19.2 Hz，1H)，3.290(s，3H)，3.12(dt，J=2.0，12.4 Hz，1H)，3.06(d，J=19.2 Hz，1H)，2.89(td，J=3.2，12.4 Hz，1H)，2.67(dd，J=4.4，13.2 Hz，1H)，2.60(d，J=15.2 Hz，1H)，1.86(d，J=13.2 Hz，1H);13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ:193.0，152.7，146.0，145.2，125.4，121.2，118.5，113.1，109.9，73.4，61.3，58.2，56.2，55.0，47.7，39.4，38.9，31.6，29.1;ESI-MS m/z 345.9［M +H］+。

4 結(jié)論

本文建立了藥用植物內(nèi)生菌對(duì)青藤堿的生物轉(zhuǎn)化模型，利用薄層色譜(TLC)及NMR 技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行了結(jié)構(gòu)確認(rèn)，為(S)-disinomenine、(R)-disinomenine 和sinomenine N-oxide。所得微生物對(duì)青藤堿的轉(zhuǎn)化多以雙青藤堿為唯一類型的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，這可能與青藤堿的剛性結(jié)構(gòu)及4 位羥基有關(guān)。青藤堿的剛性結(jié)構(gòu)可能阻礙了與微生物酶的結(jié)合，而青藤堿4 位羥基易被微生物體內(nèi)的氧化酶氧化形成偶聯(lián)產(chǎn)物，雙青藤堿的形成進(jìn)一步加劇底物與酶的結(jié)合位阻，多方面的原因?qū)е罗D(zhuǎn)化產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類型單一。為了獲得結(jié)構(gòu)豐富的微生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，在共培養(yǎng)過程中，加入氧化酶抑制劑或者改變底物結(jié)構(gòu)(如保護(hù)青藤堿4 位羥基)將是我們以后的研究方向。Sinomenine N-oxide 首次報(bào)道見于2005 年秦國(guó)偉教授等人從植物Sinomenium acutum 中分離得到，青藤堿在H2O2存在的條件下，也會(huì)發(fā)生氧化反應(yīng)生成該化合物［10］。課題組在前期的研究過程中，發(fā)現(xiàn)鄰苯二胺能誘導(dǎo)真菌Antrodiella semisupina 轉(zhuǎn)化青藤堿為Sinomenine N-oxide，其生成機(jī)制不明確［11］。本文發(fā)現(xiàn)了一種真菌與青藤堿共培養(yǎng)，在無任何誘導(dǎo)劑存在的情況下，可以直接氧化青藤堿為Sinomenine N-oxide，可為氮氧化物合成酶及類似酶促反應(yīng)提供一定參考價(jià)值。

1 Wang QX，Li XK.Immunosuppressive and anti-inflammatory activities of sinomenine.Int Immunopharmacol，2011，11:373-376.

2 Lou YT，Zhou HB，Zou J，et al.Modification of poorly bioactive sinomenine into more potent immunosuppressive agents by embedding of drug-like fragments.Tetrahedron Lett，2010，51:485-488.

3 Xiao J(肖靚)，Deng ZS(鄧張雙)，Li JX(李建新)，et al.Sinomenine based molecular design of anti-RA agents.J Huazhong Normal Univ，Nat Sci(華中師范大學(xué)學(xué)報(bào)，自科版)，2009，43:83-91.

4 Bruce NC，Boonstra B，Rathbone DA.Engineering novel biocatalytic routes for production of semisynthetic opiate drugs.Biomol Eng，2001，18(2):41-47.

5 Chen L(陳磊)，Liu Y(劉怡)，Lu JQ(盧建秋)，et al.Synthesis of hydroxy-sinomenine by microbial transformation and optimization of its transformation conditions.J Beijing Univ TCM (北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào))，2008，31:702-704.

6 Deng ZS，Li JX，Teng P，et al.Biocatalyzed cross-coupling of sinomenine and guaiacol by Antrodiella semisupina.Org Lett，2008，10:1119-1122.

7 Deng ZS，Zhao Y，He CC，et al.pH-Dependent，stereoselective dimerization of sinomenine.Org Lett，2008，10:3879-3882.

8 Teng P，Liu HL，Deng ZS，et al.Synthesis and biological evaluation of unique stereodimers of sinomenine analogues as potential inhibitors of NO production.Bioorg Med Chem，2011，19:3096-3104.

9 Joyeau R，Planchon M，Abessolo J，et al.Combinatorial approach to the selection of active microorganisms in biotransformation:Application to sinomenine.J Mol Catal B-Enzym，2013，85-86:65-70.

10 Bao GH，Qin GW，Wang R，et al.Morphinane alkaloids with cell protective effects from Sinomenium acutum.J Nat Prod，2005，68:1128-1130.

11 Xiao L(肖靚)，Deng ZS(鄧張雙)，Li JX(李建新)，et al.Induced biotransformation of sinomenine by phenylenediamine.J Huazhong Univ of Sci ＆ Tech，Nat Sci(華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)，自科版)，2009，37(8):125-128.