馬尾松胚性細胞懸浮增殖培養(yǎng)體系的建立

史 昆，楊模華，李志輝，張冬林 ,2，王 茜，丁貴杰

（1.中南林業(yè)科技大學 a.林業(yè)生物技術(shù)湖南省重點實驗室；b.林學院，湖南 長沙 410004；2.喬治亞大學，美國 喬治亞州 30602；3.貴州大學 林學院，貴州 貴陽 550000）

馬尾松胚性細胞懸浮增殖培養(yǎng)體系的建立

史 昆1a,1b，楊模華1a,1b，李志輝1b，張冬林1b,2，王 茜1b，丁貴杰3

（1.中南林業(yè)科技大學 a.林業(yè)生物技術(shù)湖南省重點實驗室；b.林學院，湖南 長沙 410004；2.喬治亞大學，美國 喬治亞州 30602；3.貴州大學 林學院，貴州 貴陽 550000）

本研究利用馬尾松未成熟胚誘導的胚性愈傷組織，首次建立馬尾松胚性愈傷組織懸浮增殖培養(yǎng)體系。實驗中定期對細胞生長參數(shù)沉淀細胞體積(SCV)、細胞活力進行了測定，研究了初始接種量，繼代細胞密度對懸浮增殖培養(yǎng)體系建立的影響。研究結(jié)果表明：不同初始接種量、繼代轉(zhuǎn)接細胞密度顯著地影響馬尾松胚性細胞懸浮培養(yǎng)的效果；在懸浮培育過程中，胚性細胞的生長周期曲線呈“S”型，細胞活力呈現(xiàn)先急劇上升，后緩慢下降的趨勢；本研究建立的馬尾松胚性細胞懸浮增殖培養(yǎng)體系為：在30 mL的培養(yǎng)基中，初始接種1.0 g胚性細胞（平均增殖系數(shù)達12.097），繼代培育以1/6作為繼代細胞密度，且繼代周期為8～12 d為宜。本研究為優(yōu)化調(diào)控馬尾松體細胞胚胎發(fā)生胚性愈傷組織穩(wěn)定增殖提供了技術(shù)支撐，同時為采用遺傳轉(zhuǎn)化及細胞融合等技術(shù)進行馬尾松新品種選育奠定了研究基礎。

生物技術(shù)；馬尾松；胚性細胞；懸浮培養(yǎng)；生長曲線

馬尾松Pinus massonianaLamb.是我國南方亞熱帶地區(qū)最重要的人工造林先鋒樹種之一，是南方營建用材林、松脂林的主栽樹種[1]。近30年來馬尾松的遺傳改良一直得到廣泛地關(guān)注[2]。林木優(yōu)良基因型的無性快繁及其利用在縮短林木育種周期，提高育種效率等方面具有絕對優(yōu)勢，體細胞胚胎發(fā)生植株再生是針葉樹優(yōu)良基因型無性擴繁的一種有效途徑，馬尾松無性快繁及體細胞胚胎發(fā)生也成為很多學者的研究熱點[3-7]。本研究組在前期的研究中發(fā)現(xiàn)，馬尾松胚性愈傷組織誘導率低（10%左右）[8-9]，成為當前把馬尾松體細胞胚胎發(fā)生技術(shù)應用于育種實踐的首個限制因子。因此，在馬尾松體細胞胚胎發(fā)生研究中，一方面繼續(xù)探討提高馬尾松胚性愈傷組織誘導率的方法，另一方面尋找能把現(xiàn)已得到的有限胚性愈傷組織進行高效增殖培養(yǎng)的方式，也是彌補胚性愈傷組織誘導率低的一個可選途徑。在已報道的馬尾松胚性愈傷增殖研究中，常常采用固體培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)，增殖效率有限[7-9]。在林木體細胞胚胎發(fā)生中，胚性細胞系液體懸浮增殖培養(yǎng)是有效擴大增殖倍數(shù)，提高增殖效率的理想途徑[10-11]。在建立胚性細胞懸浮培養(yǎng)體系中，初始接種量[12-14]及繼代細胞密度[14]常常是影響懸浮培養(yǎng)細胞生長的重要因素，沉淀細胞體積[14](sediment cell volume，SCV)和細胞活力[15-16]常常作為衡量細胞生長增殖與細胞新陳代謝的檢測指標，同時，掌握培養(yǎng)體系中細胞生長參數(shù)還是優(yōu)化調(diào)控懸浮增殖培養(yǎng)細胞體系的技術(shù)基礎。

本研究著重考察初始接種量、繼代細胞密度（舊培養(yǎng)液體積/新舊培養(yǎng)液體積和）對馬尾松胚性愈傷組織懸浮增殖培養(yǎng)的影響，測定馬尾松胚性細胞懸浮培養(yǎng)周期中SCV和細胞活力的變化，繪制生長曲線，確定最佳初始接種量、繼代細胞密度以及最佳的懸浮培養(yǎng)繼代周期，從而建立高效穩(wěn)定的馬尾松胚性細胞懸浮增殖培養(yǎng)體系，為馬尾松體細胞胚胎發(fā)生胚性愈傷組織的增殖、大規(guī)模生物反應器生產(chǎn)、馬尾松基因工程遺傳轉(zhuǎn)化以及細胞融合新品種選育等提供技術(shù)支撐和研究基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2012年7月中旬，采集湖南安化縣國家及林木良種基地馬尾松種子園自由授粉的馬尾松球果，無菌剝?nèi)y帶未成熟合子胚的雌配子體為外植體，誘導產(chǎn)生可穩(wěn)定增殖、生長狀態(tài)良好的馬尾松胚性愈傷組織，作為懸浮培養(yǎng)的初始材料，期間分別對2個細胞系材料取樣（即細胞系1-3-1和細胞系2-3-1）。基本培養(yǎng)基采用改良Litvay’s液體培養(yǎng)基[17-18]，添加0.5 mg/L 2,4-D，0.5 mg/l 6-BA，置于(23±1)℃暗培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速100 r/min。試驗在中南林業(yè)科技大學林學院森林培育實驗室于2013年3月至2013年8月進行。

1.2 試驗方法

以懸浮培養(yǎng)一定時間后測定的沉降細胞體積(sediment cell volume，SCV)作為衡量細胞生長量大小的主要參數(shù)。SCV的測定：將培養(yǎng)瓶懸浮培養(yǎng)體系中的細胞充分懸起，無菌倒出均勻懸液10 mL于刻度試管中，室溫下靜置30 min，待沉淀細胞體積不再發(fā)生變化，讀取沉淀細胞體積，得到該10 mL懸浮培養(yǎng)液中的SCV，每個母瓶中的SCV按各自比例計算得到。

1.2.1 初始接種量對懸浮培養(yǎng)細胞增殖的影響

對生長狀態(tài)良好的胚性細胞系1-3-1愈傷組織，分別取0.5、1.0、2.0 g，接種于含30 mL新鮮液體培養(yǎng)基的100 mL三角瓶中，充分振蕩混懸，置于恒溫搖床上培養(yǎng)。培養(yǎng)7 d后，測定記錄沉降細胞體積SCV1，吸取3 mL該懸液并接種于27 mL的新鮮液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)14 d后測定記錄SCV2，根據(jù)2次間隔懸浮培養(yǎng)時間的生長量計算不同初始接種量下胚性細胞的增殖系數(shù)(SCV2×10/SCV1)，每處理重復5次。

1.2.2 繼代細胞密度對懸浮培養(yǎng)細胞增殖的影響

取生長狀態(tài)良好的胚性細胞系1-3-1 1.0 g，接種于含30 mL新鮮液體培養(yǎng)基的100 mL三角瓶中，充分振蕩混勻，置于搖床上暗培養(yǎng)7 d，測定并記錄沉降細胞體積SCV3。隨后，分別吸取該均一懸液(3、5、10 mL)，用新鮮的液體培養(yǎng)基補足30 mL，繼代轉(zhuǎn)接舊培養(yǎng)液所占培養(yǎng)基總體積的比例分別為1/10，1/6，1/3。繼續(xù)培養(yǎng)至14 d后測定并記錄SCV4，分別計算不同繼代細胞密度下胚性細胞的增殖系數(shù)，增殖系數(shù)=SCV4/(舊培養(yǎng)液所占比例×SCV3)，每處理重復3次。

1.2.3 馬尾松懸浮培養(yǎng)細胞活力的測定及其生長曲線的繪制

對細胞系1-3-1和2-3-3，分別取生長狀態(tài)良好的胚性愈傷組織1.0 g，接種于含30 mL新鮮液體培養(yǎng)基的100 mL三角瓶中，在20 d的懸浮培養(yǎng)周期中，每2天測定SCV值1次，同時，采用TTC法[15-16]測定細胞活力參數(shù)OD值。每處理重復5次，每2 d測定1次，共測10次；然后根據(jù)20 d培養(yǎng)周期中細胞生長量參數(shù)SCV與細胞活力的動態(tài)變化繪制馬尾松胚性細胞懸浮培養(yǎng)的生長曲線。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用SPSS17.0對不同接種量以及不同繼代細胞密度（新舊培養(yǎng)液比例）處理下的胚性細胞增殖系數(shù)進行方差分析，LSD多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 初始接種量對懸浮培養(yǎng)細胞增殖的影響

研究表明，在30 mL液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)14天，胚性細胞的初始接種量顯著地影響馬尾松胚性愈傷組織的增殖（見表1）。0.5 g的初始接種量處理，其平均增殖系數(shù)最小(7.469±0.346)，初始接種量為1.0 g的處理，其平均增殖系數(shù)最大(12.097±1.754)，且0.5 g與1.0 g初始接種量的兩個處理間有顯著性差異(P＜0.05)；當初始接種量增加到2.0 g時，其平均增殖系數(shù)較1.0 g時有所降低，但這兩個處理間差異不顯著。比較這3個處理培養(yǎng)14天時在懸浮培養(yǎng)體系中細胞懸液的外觀表現(xiàn)，0.5 g的處理，其懸浮培養(yǎng)液呈白色、透明狀，1.0 g的處理其懸浮培養(yǎng)液呈乳白色，粘稠狀，而2.0 g的處理，此時懸浮培養(yǎng)液呈褐色、粘稠狀，已出現(xiàn)胚性愈傷的老化狀態(tài)。因此，從增殖系數(shù)的大小和懸浮細胞液外觀表現(xiàn)來綜合權(quán)衡，確定在30 mL培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)14 d時，1.0 g的初始接種量是可取的，其單次重復的增殖系數(shù)最大可達16.232，且細胞懸液的培養(yǎng)狀態(tài)好。

表1 初始接種量對馬尾松胚性細胞系1-3-1懸浮培養(yǎng)增殖系數(shù)的影響?Table 1 Effects of initial embryogenic tissue weight on proliferation coefficients of suspension cultures of cell line 1-3-1

2.2 繼代細胞密度對懸浮培養(yǎng)細胞增殖的影響

細胞系1-3-1懸浮培養(yǎng)的細胞增殖系數(shù)隨著轉(zhuǎn)接細胞密度的增加(1/10、1/6、1/3)而增加（見圖1），且3個處理的繼代細胞密度對懸浮細胞的增殖培養(yǎng)有顯著性的影響。LSD多重比較結(jié)果表明，1/10與1/6的兩處理間的增殖系數(shù)無顯著性差異，而1/10與1/3的2個處理間有顯著性差異，而1/6的處理分別與(1/10、1/3)處理間無顯著性差異。在培養(yǎng)的過程中發(fā)現(xiàn)1/6轉(zhuǎn)接細胞密度條件下，懸浮培養(yǎng)細胞的狀態(tài)好，表現(xiàn)為懸浮液為乳白色澄清，細胞分散性較好，而1/3轉(zhuǎn)接細胞密度培養(yǎng)條件下的懸浮液呈淡黃色，培養(yǎng)液略微渾濁，且細胞分散性較差。因此，在繼代轉(zhuǎn)接細胞密度的處理中，選擇1/6的轉(zhuǎn)接細胞密度處理既能獲得較好的增殖，又能保持較好的細胞增殖培養(yǎng)狀態(tài)。

圖1 繼代細胞密度對馬尾松胚性細胞系1-3-1懸浮培養(yǎng)增殖系數(shù)的影響Fig.1 Effects of cell density in subculture on proliferation coeff i cients of suspension cultures of embryogenic cell line 1-3-1

2.3 馬尾松懸浮培養(yǎng)細胞活力測定及其懸浮培養(yǎng)細胞生長曲線的繪制

在30 mL液體培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)20 d，每2 d定期測定細胞活力與沉淀細胞體積SCV，用其動態(tài)變化數(shù)據(jù)繪制2個細胞系（1-3-1和2-3-3）在該培養(yǎng)周期中的細胞生長曲線（見圖2、圖3），結(jié)果表明，懸浮培養(yǎng)細胞系的增殖生長基本上遵循“S”型生長曲線的規(guī)律。圖2和圖3中所示的SCV值（即懸浮細胞生長量）可以明顯地劃分為3個時期，緩慢生長期，快速生長期和穩(wěn)定生長期，與此同時，細胞活力值（OD值）隨著培養(yǎng)時間的推移，呈現(xiàn)出細胞活力先升后降的態(tài)勢。這說明，懸浮培養(yǎng)繼代初期，懸浮液培養(yǎng)環(huán)境中營養(yǎng)充足，細胞新陳代謝活動旺盛，細胞活力上升至一個峰值，隨著細胞增殖，細胞數(shù)量增加，消耗培養(yǎng)基中的部分營養(yǎng)，此時培養(yǎng)細胞的新陳代謝活動受到一定程度的限制，表現(xiàn)為細胞活力OD值的降低，這也是細胞內(nèi)外環(huán)境之間營養(yǎng)供給與生長動態(tài)平衡相適應的結(jié)果。

總體而言，在懸浮培養(yǎng)的前6 d期間，懸浮培養(yǎng)液中細胞數(shù)量和沉淀細胞體積逐漸增加，隨之細胞活力大幅度上升，指示此時懸浮培養(yǎng)液中胚性細胞新陳代謝活動逐漸旺盛；在6～10 d（圖2細胞系1-3-1）或6～12 d（圖3細胞系2-3-3）期間，盡管胚性細胞SCV數(shù)量還在不斷地增加，但細胞活力卻由前期的活力峰值下降到與轉(zhuǎn)接繼代時幾乎持平的細胞活力OD值水平；在12～20 d（圖2細胞系1-3-1）或14～20 d（圖3細胞系2-3-3）期間，懸浮培養(yǎng)細胞的SCV數(shù)量緩慢增加直至出現(xiàn)細胞SCV的靜止期，此時沉淀細胞體積的增加達到一個平臺峰值，而培養(yǎng)液中細胞活力卻并不隨細胞SCV量的增加而上升，反而出現(xiàn)低于初始繼代培養(yǎng)時的細胞活力值水平，并保持逐漸降低的態(tài)勢至較低的水平，這說明，在14～20 d的懸浮增殖期間，盡管細胞SCV值達到了該培養(yǎng)周期中的最高水平，但細胞的新陳代謝活動已經(jīng)明顯地受到了抑制，原培養(yǎng)液中的有效養(yǎng)分條件供給與細胞增殖與活力保持之間出現(xiàn)了不平衡，因此，綜合分析，為既能較好的保持細胞活力，又能較好的維持細胞良好的增殖態(tài)勢，8～12 d應為馬尾松胚性細胞系懸浮增殖培養(yǎng)適宜的繼代間隔周期。

圖2 細胞系1-3-1懸浮細胞生長曲線及細胞活力的動態(tài)變化Fig.2 Growth kinetic of cell line 1-3-1 and changes of cell viability in suspension culture

圖3 胚性細胞系2-3-3懸浮細胞生長曲線及細胞活力的動態(tài)變化Fig.3 Growth kinetic of embryogenic cell line 2-3-3 and changes of cell viability in suspension culture

3 結(jié)論與討論

建立一個穩(wěn)定高效的馬尾松胚性細胞懸浮培養(yǎng)體系，對馬尾松體細胞胚胎發(fā)生快繁利用意義重大，也是進行馬尾松基因工程遺傳轉(zhuǎn)化的良好平臺。初始接種量、轉(zhuǎn)接細胞密度，繼代周期等都是影響一個細胞懸浮培養(yǎng)體系中的關(guān)鍵因子。初始接種量對懸浮細胞的生長和增殖產(chǎn)生顯著性影響。馬尾松胚性細胞懸浮培養(yǎng)細胞生長曲線的研究結(jié)果表明其增殖過程經(jīng)歷緩慢生長期，快速生長期，穩(wěn)定生長期，甚至在細胞系2-3-3的后期出現(xiàn)了生長的衰退。本研究中在30 mL培養(yǎng)液中，分別設置3個不同的初始接種量0.5、1.0、2.0 g，結(jié)果表明，1.0 g的初始接種量，胚性愈傷組織增殖系數(shù)達到最大，培養(yǎng)液呈乳白色，粘稠狀，懸浮培養(yǎng)細胞的整體狀態(tài)良好，從而確定30 mL培養(yǎng)液中添加1.0 g胚性愈傷為馬尾松懸浮培養(yǎng)體系的最佳初始接種量。較小的接種量（如0.5 g），懸浮細胞培養(yǎng)液呈澄清狀，這說明細胞增殖的延遲期延長；而較大的接種量（如2.0 g），懸浮細胞培養(yǎng)液粘稠、顏色發(fā)褐，說明細胞很快結(jié)束對數(shù)增長期而進入靜止期和衰亡期，細胞衰老，這將不利于保持胚性細胞良好的增殖態(tài)勢。懸浮培養(yǎng)過程中初始接種量的確定，還與懸浮培養(yǎng)體系的大小以及懸浮培養(yǎng)細胞的類型有關(guān)，如Salaj等[14]在歐洲黑松Pinus nigraArn胚性細胞懸浮培養(yǎng)研究中表明：25 mL的培養(yǎng)液中1.0 g或2.5初始接種量均有利于黑松胚性細胞的生長；楊金玲等[12]在白杄Picea meyeriRehd. et Wils胚性愈傷組織的懸浮培養(yǎng)研究中表明，50 mL液體培養(yǎng)基中添加1.5 g(3%)白杄胚性愈傷組織最有利于其懸浮體系的建立；楊映根等[13]對青杄Picea wilsoniiMast 胚性細胞懸浮培養(yǎng)的研究結(jié)果表明，50 mL培養(yǎng)液中添加2%的胚性愈傷組織為其最佳的初始接種量。

繼代細胞密度對馬尾松懸浮細胞培養(yǎng)體系的建立有顯著性影響，增殖系數(shù)隨著繼代細胞密度（1/10、1/6、1/3繼代(舊/新)營養(yǎng)液的體積比）的增加而增加。Salaj等[14]對歐洲黑松的懸浮培養(yǎng)研究也表明，當繼代SCV體積從3 mL增加到5 mL時，可以有效地提高增殖緩慢細胞系的增殖效率。本研究中的結(jié)果表明，過高的繼代細胞密度（如1/3），容易出現(xiàn)懸浮培養(yǎng)液變渾濁，顏色變褐的現(xiàn)象，不利于馬尾松胚性細胞系的穩(wěn)定增殖與胚性保持，而中等水平的繼代細胞密度(1/6)，增殖系數(shù)高，且能維持細胞正常的生長狀態(tài)，因此，本研究中選定1/6水平為馬尾松懸浮培養(yǎng)的繼代細胞密度。

1983年Mosmam[19]首次提出TTC比色法快速檢測懸浮培養(yǎng)體系中活細胞線粒體琥珀酸脫氫酶活性，測得細胞活力OD值，作為表征細胞生長、增殖，新陳代謝旺盛程度的一個相對衡量指標。馬尾松胚性細胞懸浮培養(yǎng)生長周期中，細胞體積的增加呈“S”型，并達到一個穩(wěn)定期，而細胞活力呈先上升后下降的趨勢。這一規(guī)律性變化，反映了培養(yǎng)周期內(nèi)胚性培養(yǎng)物對培養(yǎng)基中養(yǎng)分的吸收和利用情況。在懸浮培養(yǎng)初期，培養(yǎng)基中營養(yǎng)豐富，細胞增殖，細胞數(shù)量不斷增多，細胞新陳代謝較旺盛，與此同時，逐漸消耗培養(yǎng)基中的營養(yǎng)，因此，細胞體積增加，細胞活力呈快速上升狀態(tài)；而當細胞增殖一定時間，細胞數(shù)量達到一定量時，培養(yǎng)液中有害代謝產(chǎn)物增多，有效養(yǎng)分減少，細胞的生長和增殖受到一定的抑制，新陳代謝逐漸變慢，細胞活力下降；細胞因為得不到充足養(yǎng)分，部分細胞老化或液泡化，導致細胞體積增長高峰延后的出現(xiàn)，細胞活力持續(xù)下降，直至出現(xiàn)細胞生長的停滯，甚至老化，懸浮培養(yǎng)液外觀表現(xiàn)上由乳白色變得粘稠，褐化。因此，結(jié)合馬尾松懸浮培養(yǎng)的細胞生長周期規(guī)律，為了讓懸浮細胞活力狀態(tài)表現(xiàn)良好，選擇懸浮培養(yǎng)繼代周期為8～12 d比較適宜。另外，當把該馬尾松懸浮培養(yǎng)體系作為馬尾松轉(zhuǎn)基因操作，胚性細胞融合的技術(shù)平臺時，最好選擇懸浮培養(yǎng)4～6 d的胚性細胞，此時其細胞活力值最高，新陳代謝最為旺盛。

本研究首次建立了馬尾松胚性愈傷組織懸浮培養(yǎng)體系，確定了30 mL液體培養(yǎng)基中最佳初始接種量為1.0 g新鮮的胚性愈傷組織；在繼代培養(yǎng)時，以1/6的繼代細胞密度為宜，在增殖系數(shù)較高的同時細胞增殖狀態(tài)俱佳；通過定期測定2個胚性細胞系懸浮培養(yǎng)細胞的SCV和細胞活力，繪制出馬尾松胚性細胞懸浮培養(yǎng)生長周期曲線的動態(tài)變化，確定了8～12 d為馬尾松胚性細胞懸浮培養(yǎng)的最宜繼代周期。本研究在馬尾松體細胞胚胎發(fā)生中，利用懸浮增殖體系進一步擴繁所獲得的馬尾松胚性愈傷，為馬尾松優(yōu)良無性系的規(guī)模化擴繁提供了技術(shù)基礎，并為馬尾松基因工程遺傳轉(zhuǎn)化，以及采用細胞融合進行馬尾松新品種選育提供了技術(shù)平臺。

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Establishment of embryogenic suspension cultures in somatic embryogenesis of Pinus massoniana Lamb.

SHI Kun1a,1b, YANG Mo-hua1a,1b, LI Zhi-hui1b, ZHANG Dong-lin1b,2, WANG Qian1b, DING Gui-jie3
(1a. Hunan Provincial Key Lab. of Forestry Biotechnology; b.College of Forestry, Central South University of Forestry and Technology,Changsha 410004, Hunan, China; 2. University of Georgia, GA 30602, USA; 3. College of Forestry, Guizhou University, Guiyang 550000, Guizhou, China)

The objective of the study was to establish the embryogenic tissues suspension proliferation system using the embryogenic tissues initiated from immature zygotic embryos inPinus massonianaLamb. (masson pine). The effects of initial tissues weight and cell density in subculture were investigated through measuring the sediment cell volume (SCV) and cell viability during the establishment of suspension proliferation system. The results showed that the growth of embryogenic tissues was signif i cantly inf l uenced by initial tissues weight and cells density in suspension cultures; the embryogenic cells growth basically accorded with the “S” growth curve, while the cells viability sharply increased at fi rst and gradually decreased in later. A better suspension proliferation system in masson pine embryogenic cultures was established: 1.0 g tissues per 30 mL fresh liquid media were the appropriate initial tissues weight (the mean growth rate was up to 12.097); then the better cell density in subculture was 1/6 and the appropriate subculture period was identif i ed as 8～12 days. This study provide basic information for optimization of mass propagation in masson pine somatic embryogenesis. The establishment of suspension system is also a basic technique for new variety breeding of masson pine through genetic transformation and cell fusion in masson pine breeding.

biological technology;Pinus massonianaLamb.; embryogenic cultures; suspension culture; growth curve

S791.248

A

1673-923X(2014)01-0064-05

2013-09-20

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（863計劃）課題（2011AA100203），湖南省自然科學基金項目（11JJ3038），國家自然科學基金青年項目（31200481），教育部博士點基金博導類聯(lián)合資助項目（20104321110002）

史 昆（1988-），男，山西大同人， 碩士研究生，研究方向：林木種苗培育與理論

楊模華（1974-），女，湖南常德人，副教授，博士，研究方向：林業(yè)生物技術(shù)、森林培育教學和科研；

E-mail：ymh163@163.com

[本文編校：吳 毅]