異煙肼敏感與耐藥結(jié)核桿菌臨床分離株培養(yǎng)濾液蛋白比較分析

曹翌明 孟繁榮 謝 貝 蔡杏珊 黃業(yè)倫 牛 群 雷 杰 高俊文譚耀駒 劉志輝

異煙肼(Isoniazid，INH)具有強(qiáng)大的殺菌作用，可殺滅細(xì)胞內(nèi)外的結(jié)核桿菌，在抗結(jié)核化療中系“全效殺菌藥”，是當(dāng)今最為重要的抗結(jié)核藥物之一。但是異煙肼耐藥結(jié)核桿菌株的出現(xiàn)與流行［1］目前已成為結(jié)核病臨床與控制中的重大問(wèn)題，對(duì)異煙肼和利福平同時(shí)耐藥而致耐多藥結(jié)核病(Multidrug-Resistant Tuberculosis，MDR - TB)更被視為“白色瘟疫”［2］。其耐藥性診斷目前主要依據(jù)藥物敏感性測(cè)定結(jié)果，但現(xiàn)行的比例法測(cè)定至少需要4 w 之久;新近WHO 推薦的Xpert MTB/RIF 方法對(duì)katG 等結(jié)核桿菌異煙肼耐藥基因檢測(cè)雖然較為快速，但因技術(shù)條件要求較高而難于在基層單位普及推廣應(yīng)用［3］，也因異煙肼耐藥機(jī)制復(fù)雜導(dǎo)致這些耐藥基因檢測(cè)指示結(jié)核桿菌異煙肼耐藥的敏感性并不理想［4］。因此，準(zhǔn)確、快速、經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便的結(jié)核桿菌耐藥性測(cè)定新方法的探索一直為人們所關(guān)注，新型檢測(cè)標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)則是其關(guān)鍵。目前不少研究表明異煙肼耐藥和敏感結(jié)核桿菌蛋白質(zhì)組存在差異，它們很有可能成為新的診斷和治療靶蛋白［5-6］。同時(shí)受我們前期有關(guān)結(jié)核桿菌特異性分泌蛋白MPT64 檢測(cè)可以準(zhǔn)確、快速檢測(cè)鑒定結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群與非結(jié)核分枝桿菌研究結(jié)果［7］的啟發(fā)，我們推測(cè)在異煙肼耐藥和敏感結(jié)核桿菌間也許可能存在此種差異分泌蛋白而可作為耐藥性測(cè)定新型標(biāo)志物。為此我們應(yīng)用表面增強(qiáng)激光解析-電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(Surface -Enhanced Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry，SELDI - TOF -MS)技術(shù)對(duì)1 株異煙肼單耐藥結(jié)核桿菌和1 株異煙肼敏感結(jié)核桿菌臨床分離株7 天及14 天Middlebrook 7H9 培養(yǎng)濾液蛋白進(jìn)行了初步分析和比較，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 分析菌株

在本院所建廣東地區(qū)分枝桿菌菌株庫(kù)中采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)抽取對(duì)異煙肼、利福平、鏈霉素、乙胺丁醇4 種藥物全部敏感或僅對(duì)異煙肼耐藥的結(jié)核桿菌臨床分離株各1 株。

1.2 主要儀器與試劑

1.2.1 主要儀器 應(yīng)用Bruker Autoflex 2.0 質(zhì)譜儀分析弱陽(yáng)離子交換蛋白質(zhì)芯片(WCX2)磁珠捕獲的培養(yǎng)濾液蛋白質(zhì)。

1.2.2 主要試劑 購(gòu)買BD 公司Middlebrook 7H9 培養(yǎng)基瓊脂粉、OADC 促生長(zhǎng)劑自行配制分枝桿菌Middlebrook 7H9 液體培養(yǎng)基;應(yīng)用布魯克公司弱陽(yáng)離子交換蛋白質(zhì)芯片(WCX2)磁珠捕獲培養(yǎng)濾液蛋白組份。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 結(jié)核桿菌培養(yǎng) 按試劑說(shuō)明書配制Middlebrook 7H9液體培養(yǎng)基(約8 毫升/支)，將復(fù)蘇后菌株分別接種于4 支培養(yǎng)基(每支培養(yǎng)基接種凍存液約0.1 ml)，37 ℃溫箱孵育。

1.3.2 培養(yǎng)濾液制備 在培養(yǎng)第7 天、第14 天分別對(duì)每株各2 支培養(yǎng)液用0.22 μm 濾紙過(guò)濾，制備約2 ml 濾液分裝于3 支潔凈凍存管，-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 生物質(zhì)譜用蛋白質(zhì)分析樣品制備 主要包括磁珠捕獲目的蛋白、磁珠結(jié)合蛋白分離與純化、磁珠與目的蛋白分離等步驟:①將磁珠結(jié)合緩沖液10 μl、WCX2 磁珠10 μl、培養(yǎng)濾液5 μl 加至200 μl 樣品管混勻，室溫靜置5 min，WCX2磁珠捕獲目的蛋白;②在磁株分離器中使磁珠貼壁，使其與懸浮液體分離;③移除懸浮液，加100 μl 磁珠清洗緩沖液，置磁珠分離器中1 min，使磁珠貼壁，移除懸浮液，重復(fù)操作2次，徹底清除磁珠表面粘附的非目標(biāo)分析物;④加5 μl 磁珠洗脫緩沖液，置于磁珠分離器中2 min，使磁珠貼壁，使其與懸浮液充分分離;⑤移取懸浮上清液于約0.5 ml 的樣品管，并加入相應(yīng)的穩(wěn)定緩沖液，即得質(zhì)譜分析樣品。具體實(shí)驗(yàn)操作見(jiàn)試劑說(shuō)明書。

1.3.4 蛋白質(zhì)樣品生物質(zhì)譜分析 按儀器操作程序清潔Anchorchip 靶與調(diào)整質(zhì)譜儀參數(shù);將1 μl 標(biāo)準(zhǔn)品、分析樣品與10 μl 基質(zhì)液混勻，取1 μl 點(diǎn)于600 μm Anchorchip 靶的樣品位上，室溫干燥幾分鐘后放入質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)分析;利用ClinProTools 分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集與處理。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

以質(zhì)荷比(m/z)而得的相對(duì)分子量判斷蛋白質(zhì)/多肽種類，由用質(zhì)譜峰面積計(jì)算而得的相對(duì)強(qiáng)度表示培養(yǎng)濾液蛋白質(zhì)豐度，描述性分析與比較培養(yǎng)濾液差異蛋白質(zhì)的種類、相對(duì)分子量范圍和表達(dá)豐度水平。

2 結(jié)果

2.1 異煙肼敏感和異煙肼單耐藥結(jié)核桿菌株7 天及14 天Middlebrook 7H9 培養(yǎng)濾液蛋白質(zhì)生物質(zhì)譜分析結(jié)果

在異煙肼敏感和異煙肼單耐藥結(jié)核桿菌株7 天及14 天Middlebrook 7H9 培養(yǎng)濾液中分別檢測(cè)到164、175、133、147種蛋白質(zhì)/多肽，具體情況見(jiàn)表1。

2.2 異煙肼敏感和異煙肼單耐藥結(jié)核桿菌株7 天及14 天Middlebrook 7H9 培養(yǎng)濾液差異蛋白質(zhì)

異煙肼單耐藥結(jié)核桿菌株與異煙肼敏感結(jié)核桿菌株相比較，7 和14 天培養(yǎng)濾液分別存在47 與58 種差異蛋白質(zhì)/多肽，這些差異蛋白質(zhì)相對(duì)分子量在1 083 ～8 812、1 012 ～9 327之間，表達(dá)豐度在76 ～1 811、25 ～3 010 之間。

表1 7 天及14 天Middlebrook 7H9 培養(yǎng)濾液蛋白質(zhì)生物質(zhì)譜分析結(jié)果

3 討論

新近研究表明分枝桿菌能通過(guò)其特有的分泌系統(tǒng)分泌多種生物活性蛋白質(zhì)而參與病原體和宿主的相互作用［8］，在異煙肼敏感和異煙肼單耐藥結(jié)核桿菌株7 天及14 天Middlebrook 7H9 培養(yǎng)濾液中分別檢測(cè)到164、175、133、147 種蛋白質(zhì)/多肽，即表明結(jié)核桿菌在培養(yǎng)的早期開始即有活躍的蛋白質(zhì)代謝與分泌活動(dòng)。異煙肼敏感和異煙肼單耐藥結(jié)核桿菌是否可能通過(guò)改變其蛋白質(zhì)分泌活動(dòng)而表現(xiàn)其生物學(xué)行為，目前不得而知。我們所得到的異煙肼單耐藥結(jié)核桿菌株與異煙肼敏感結(jié)核桿菌株7 和14 天培養(yǎng)濾液分別存在47 與58 種差異蛋白質(zhì)/多肽的實(shí)驗(yàn)結(jié)果則提示了此種可能性。從這些差異蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量和表達(dá)豐度來(lái)看，它們均為低豐度小分子量蛋白質(zhì)，符合細(xì)菌分泌蛋白質(zhì)的表觀特征。

但是我們應(yīng)用的Middlebrook 7H9 液體培養(yǎng)基含有牛血清白蛋白Ⅴ、觸酶等蛋白質(zhì)成份，和張為民等［9］的研究結(jié)果類似，在Middlebrook 7H9 液體培養(yǎng)基中檢測(cè)到近100 種蛋白質(zhì)/多肽，可以肯定的是:我們?cè)诋悷熾聠文退幗Y(jié)核桿菌株與異煙肼敏感結(jié)核桿菌株7 和14 天培養(yǎng)濾液中檢測(cè)到的蛋白質(zhì)相當(dāng)部分來(lái)自細(xì)菌生命活動(dòng)對(duì)培養(yǎng)基蛋白質(zhì)成份進(jìn)行的代謝。而且我們通過(guò)對(duì)不同結(jié)核桿菌菌株的Middlebrook 7H9 培養(yǎng)濾液蛋白質(zhì)進(jìn)行分析得到如下結(jié)果:在體外液體培養(yǎng)條件下，不同結(jié)核桿菌菌株間的蛋白質(zhì)代謝和分泌活動(dòng)存在較大差異［10］。繼之而來(lái)的問(wèn)題是:我們檢測(cè)到的異煙肼單耐藥結(jié)核桿菌株與異煙肼敏感結(jié)核桿菌株7 和14 天培養(yǎng)濾液中存在的差異蛋白哪些來(lái)自細(xì)菌對(duì)培養(yǎng)基蛋白成份的代謝活動(dòng)、哪些來(lái)自細(xì)菌的個(gè)體差異、又有哪些的確緣自異煙肼結(jié)核桿菌所特有的蛋白質(zhì)分泌活動(dòng)?使用無(wú)蛋白質(zhì)成份的培養(yǎng)基進(jìn)行多菌株間的分析比較有望能夠揭示這些問(wèn)題，我們目前正在進(jìn)行這方面的工作。

［1］ 肖東樓. 全國(guó)結(jié)核病耐藥性基線調(diào)查報(bào)告(2007 -2008 年)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2010:2 -3.

［2］ 鐘 球. 現(xiàn)代結(jié)核病控制面臨的三大挑戰(zhàn)［J］. 廣東醫(yī)學(xué)，2010，31(15):1905 -1907.

［3］ KIK S V，DENKINGER C M，CASENGHI M，et al. Tuberculosis diagnostics:which target product profiles should be prioritised?［J］. Eur Respir J，2014 Apr 2. DOI:10. 1183/09031936.00027714.

［4］ WILSON M L. Rapid diagnosis of Mycobacterium tuberculosis infection and drug susceptibility testing［J］. Arch Pathol Lab Med，2013，137(6):812 -819.

［5］ 樂(lè) 軍，劉麗蓉，謝建平，等.異煙肼耐藥和敏感結(jié)核分枝桿菌的比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究［J］. 中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2004，24(4):258 -262.

［6］ JIAN X，ZHANG W，GAO F，et al. Comparison of the proteome of isoniazid-resistant and -susceptible strains of Mycobacterium tuberculosis［J］.Microb Drug Resist，2006，12(4):231 -238.

［7］ 劉志輝，蔡杏珊，劉玉美，等.MPB64 分泌蛋白檢測(cè)鑒定結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的應(yīng)用研究［J］. 國(guó)際呼吸雜志，2010，30(18):1100 -1103.

［8］ ABDALLAH AML，GEY VAN PITTIUS NC，CHAMPION PA，et al. Type VII secretion-mycobacteria show the way［J］. Nat Rev Microbiol，2007，5(11):883 -891.

［9］ 張為民，吳勁松，龔文波.恥垢分枝桿菌7 天培養(yǎng)濾液與Middlebrook 7H9 培養(yǎng)液蛋白質(zhì)組對(duì)比分析［J］. 現(xiàn)代醫(yī)院，2013，13(8):8 -10.

［10］ 黃業(yè)倫，孟繁榮，謝 貝，等.結(jié)核桿菌臨床分離菌早期培養(yǎng)濾液蛋白質(zhì)組的比較［J］.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2013，29(15):2456 -2458.