不同制片方法對乳腺疾病DNA倍體分析的影響

[摘要] 目的 摸索三種不同制片方法對乳腺疾病石蠟組織細(xì)胞的DNA進(jìn)行定量分析，探討三種方法的優(yōu)劣及其在細(xì)胞DNA定量分析過程中的影響。 方法 本實(shí)驗(yàn)采用常規(guī)制片脫蠟法、常規(guī)制片脫蠟酶消法、石蠟組織制備細(xì)胞懸液法，分別對80例乳腺疾病的石蠟組織進(jìn)行Feulgen染色，應(yīng)用全自動DNA倍體分析儀對DNA染色玻片進(jìn)行掃描分析。 結(jié)果 在三種方法中，常規(guī)制片脫蠟法染色結(jié)果不理想，常規(guī)制片脫蠟酶消法取得了最佳的染色效果，而石蠟組織制備細(xì)胞懸液法制備的玻片上部分區(qū)域存在一定的細(xì)胞重疊現(xiàn)象。 結(jié)論 常規(guī)制片脫蠟酶消法可用于乳腺疾病石蠟切片的DNA倍體分析。

[關(guān)鍵詞] DNA倍體分析；乳腺疾??；制片方法

[中圖分類號] R44 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] B [文章編號] 1673-9701（2013）14-0053-03

乳腺癌是危害婦女健康的最常見的惡性腫瘤之一。乳腺癌前病變尤其是非典型性增生與乳腺癌關(guān)系相當(dāng)密切，以組織細(xì)胞學(xué)形態(tài)為主要根據(jù)判斷乳腺癌前病變與乳腺原位癌有時相當(dāng)困難[1-3]。DNA異倍體的形成是一個多因素相互作用的結(jié)果，已有很多報(bào)道表明，DNA倍體與臨床分期、增殖和預(yù)后有關(guān)。DNA倍體檢測與分析的技術(shù)方法目前在細(xì)胞學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[4-6]，但在乳腺疾病實(shí)體組織中的應(yīng)用國內(nèi)未見報(bào)道。本研究使用三種制片方法對乳腺疾病的石蠟組織進(jìn)行細(xì)胞DNA定量分析，旨在摸索出一種穩(wěn)定有效的實(shí)體組織DNA倍體分析制片方法，為乳腺疾病DNA倍體分析檢測提供前提和必要條件。本文將三種制片方法及其質(zhì)量等作一比較分析。

1 材料與方法

1.1 材料

收集我院2012年10～12月送檢乳腺疾病實(shí)體組織蠟塊并進(jìn)行篩選分組，分組如下：乳腺增生癥20例，乳腺非典型增生疾病20例，乳腺原位癌20例，乳腺浸潤性癌蠟塊20例。每例病例選取最具代表性的蠟塊各一塊，共80塊蠟塊。

1.2 制片

分三組對80個蠟塊進(jìn)行DNA倍體分析前制片工作。

1.2.1 A組（常規(guī)制片脫蠟法） 80個蠟塊進(jìn)行常規(guī)石蠟切片，使用切片機(jī)行2μm厚切片1張。石蠟切片于56℃烤片15 min，二甲苯脫蠟10min，75%乙醇、95%乙醇、無水乙醇梯度脫水各5 min，蒸餾水清洗后進(jìn)行。

1.2.2 B組（常規(guī)制片脫蠟酶消法） 80個蠟塊進(jìn)行常規(guī)石蠟切片，使用切片機(jī)行2μm厚切片1張。石蠟切片于56℃烤片15 min，二甲苯脫蠟，75%乙醇、95%乙醇、無水乙醇梯度脫水各5 min，蒸餾水清洗，蒸餾水中高壓修復(fù)2 min 30 s，37℃胃蛋白酶消化5min，PBS清洗。

1.2.3 C組（石蠟組織制備細(xì)胞懸液法） 80個蠟塊進(jìn)行常規(guī)石蠟切片，使用切片機(jī)行5 μm厚切片10張。經(jīng)56℃二甲苯脫蠟20 min，75%乙醇、95%乙醇、無水乙醇梯度脫水各5 min，加入3 mL膠原酶消化液，置37℃恒溫水浴鍋中消化30 min并不斷用吸管吹打，1 000轉(zhuǎn)/5 min離心沉淀，收集細(xì)胞懸液，低滲液低滲15 min，1 000轉(zhuǎn)/5 min離心沉淀，PBS液漂洗2次，1 000轉(zhuǎn)/5 min離心沉淀。80例均制備細(xì)胞懸液涂片，鏡下觀察確保保留完整的細(xì)胞核。

1.3 染色

將A、B、C三組玻片置B.S 固定液中固定50 min；流水洗滌1 min；5N鹽酸酸解1 h，室溫 （25±2）℃；流水洗滌1 min；將切片置Feulgen染液中染色75 min，室溫（25± 2）℃[2]；流水洗滌1 min后，蒸餾水中浸洗15 min[7]。

1.4 脫水

玻片置于75%乙醇、95%乙醇、無水乙醇梯度脫水各5 min。

1.5 封片

將玻片依次置于無水乙醇： 二甲苯（1：1）、100% 二甲苯、100%二甲苯中3 min；再一張張取出，滴加中性樹膠進(jìn)行封片。

1.6 細(xì)胞DNA定量分析

三組所有玻片經(jīng)Feulgen 染色后采用Motic BA600全自動高分辨率細(xì)胞DNA圖像定量分析系統(tǒng)（全自動DNA倍體分析儀）進(jìn)行掃描分析。系統(tǒng)硬件由全自動數(shù)碼顯微鏡Motic600及攝像頭205C組成，對每個標(biāo)本的單張玻片中約8 000個細(xì)胞核進(jìn)行掃描測定，以標(biāo)本單張玻片中的正常細(xì)胞作為內(nèi)參，同時進(jìn)行100多個參數(shù)的特征值的處理分析，并根據(jù)其不同數(shù)值自動完成細(xì)胞計(jì)數(shù)和分類。其中表示DNA含量的DNA指數(shù)（DNA Index，DI）為關(guān)鍵參數(shù)， DI值的計(jì)算方法為：被測細(xì)胞的積分光密度（IOD）與正常細(xì)胞積分光密度的比值。正常上皮細(xì)胞DI 值范圍在（1±0.25）之間；當(dāng)1.25 < DI < 2.5時，可判斷為增生或疑似病變的細(xì)胞；病變細(xì)胞均為DI≥2.5[8]。該系統(tǒng)會自動識別重疊細(xì)胞核及玻片中細(xì)胞核碎片等不參與診斷的垃圾細(xì)胞（染料殘留也會偶爾出現(xiàn)，也歸于垃圾細(xì)胞類），而淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞也會被分析，分類在相應(yīng)的淋巴細(xì)胞組別和粒細(xì)胞組別。在臨床工作中由細(xì)胞技術(shù)員在顯微鏡下對DI≥2.5的所有細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)核辨別，確保DNA 定量分析檢測的準(zhǔn)確。

使用ICLASSY軟件進(jìn)行圖像分析，觀察A、B、C三組玻片中各個樣本的細(xì)胞成像情況、IOD值、MEAN值等指標(biāo)。被測細(xì)胞的積分光密度（IOD）[9]和平均峰值是判定該實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重要參數(shù)，前者決定每個細(xì)胞最后的DI值，后者決定標(biāo)本是否存在標(biāo)準(zhǔn)化偏差。

2 結(jié)果

2.1 A組（常規(guī)制片脫蠟法）

掃描玻片中細(xì)胞數(shù)量均達(dá)8 000個，鏡下細(xì)胞核基本為平層，細(xì)胞核完整、少見破裂現(xiàn)象，玻片中有紅細(xì)胞、炎細(xì)胞存在。部分細(xì)胞染色較深，部分細(xì)胞染色較淺，IOD值均偏大，在145～165之間，不符合最佳染色深度觀察指標(biāo)。平均峰值均在1.3以上，不符合最佳染色標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 B組（常規(guī)制片脫蠟酶消法）

掃描玻片中細(xì)胞數(shù)量均達(dá)8 000個，鏡下細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰、背景干凈，細(xì)胞核完整，少量紅細(xì)胞、炎細(xì)胞存在。染色均一， IOD值在120左右，符合最佳染色深度觀察范圍。平均峰值在0.98～1.2之間，符合最佳染色標(biāo)準(zhǔn)。

2.3 C組（石蠟組織制備細(xì)胞懸液法）

玻片細(xì)胞集中，滴片范圍符合計(jì)算機(jī)掃片需要，其中3例細(xì)胞數(shù)量偏少，未達(dá)到8 000個細(xì)胞。鏡下細(xì)胞部分區(qū)域有重疊凝集現(xiàn)象，但基本為一層，細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰、無紅細(xì)胞干擾，有少量炎細(xì)胞存在。染色均一，IOD值在110～130之間，符合最佳染色深度觀察范圍。平均值在0.98～1.2之間，符合最佳染色標(biāo)準(zhǔn)。

從上述情況分析，B組質(zhì)量最好，C組其次，A組較差。

3 討論

早期診斷、早期治療是防治乳腺癌的關(guān)鍵，近年來圍繞乳腺癌的各種研究一直很活躍，大量的乳腺疾病文獻(xiàn)指出，單純依靠形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行診斷存在兩方面的問題[10]：①由于各個病理醫(yī)師由于經(jīng)驗(yàn)和認(rèn)識的不同對同一標(biāo)本存在不同的主觀性，進(jìn)而得出不同的結(jié)論。②經(jīng)常發(fā)現(xiàn)病理分級相同的腫瘤在臨床上出現(xiàn)不同的生物學(xué)行為和預(yù)后。因此，如何更客觀地反映腫瘤的生物學(xué)行為，已成為腫瘤病理學(xué)研究的重要課題。腫瘤遺傳學(xué)表明，細(xì)胞核DNA是細(xì)胞的遺傳物質(zhì)，是決定細(xì)胞生長、分化、分裂和各種形狀的重要因素[11]。正常細(xì)胞核DNA含量二倍體形式存在， DNA含量變化多為倍性增加，直接反映腫瘤增殖活性的大小。良性腫瘤多以四倍體等形式增殖，而以異倍體增殖多為惡性腫瘤[12，13]。

本文采用全自動細(xì)胞DNA倍體分析來判斷預(yù)測乳腺疾病進(jìn)程，是近來研究乳腺癌前病變領(lǐng)域的新手段[14～16]，取得石蠟切片穩(wěn)定正確的分析結(jié)果的基礎(chǔ)是摸索出穩(wěn)定的石蠟切片進(jìn)行Feulgen染色制片方法，在整個DNA倍體分析過程中，制片及其染色質(zhì)量會嚴(yán)重影響到報(bào)告的診斷質(zhì)量，對不利因素加以控制，做好質(zhì)控，對計(jì)算機(jī)讀取結(jié)果正確分析判斷，才能保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。

我們的三組試驗(yàn)均在同一實(shí)驗(yàn)室同一實(shí)驗(yàn)條件下完成。對三個不同分組的形態(tài)學(xué)及特征參數(shù)進(jìn)行分別比較。首先進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察其細(xì)胞核形態(tài)是否完整、是否存在多數(shù)重疊等現(xiàn)象，其次根據(jù)細(xì)胞的積分光密度（IOD值）以確定正常二倍體峰的位置。不同組分的細(xì)胞IOD值不同，如粒細(xì)胞峰的IOD通常會比正常二倍體峰IOD稍低一些，根據(jù)這一點(diǎn)，可以判斷正常二倍體峰是否標(biāo)準(zhǔn)化正確。標(biāo)本操作指南中推薦IOD值在110左右，偏差20%的視為無效玻片，需進(jìn)行重新掃描或重新制片。再次根據(jù)平均峰值，平均峰值通常在0.98～1.02這個范圍，標(biāo)準(zhǔn)化正常的值偏差應(yīng)該在2%以內(nèi)，如果標(biāo)準(zhǔn)化的值偏出這個范圍，做分析時就必須要注意。

A組（常規(guī)制片脫蠟法）采用常規(guī)石蠟制片脫蠟方法制片，經(jīng)Feulgen染色后進(jìn)行計(jì)算機(jī)處理分析，但因未作任何特殊處理，細(xì)胞膜上及DNA外包裹蛋白較厚，染料無法滲透均勻，故染色后細(xì)胞深淺不均一，計(jì)算機(jī)掃描處理后數(shù)據(jù)不佳，IOD值及MEAN值均不在推薦范圍內(nèi)，造成分析軟件無法進(jìn)行DNA倍體分析的現(xiàn)象。該組最大的優(yōu)點(diǎn)是制作簡便，只需在常規(guī)制作石蠟切片時多切一張用于DNA倍體分析即可，但鑒于其染色效果不理想，不推薦采用此種制片方法。

B組（常規(guī)制片脫蠟酶消法）制片質(zhì)量最佳。該組也是采用常規(guī)石蠟制片脫蠟方法制片，但其進(jìn)行了高壓修復(fù)，高壓修復(fù)一般用于甲醛固定石蠟包埋后組織的免疫組化中，加熱使抗原性物質(zhì)分子運(yùn)動加劇，使抗原暴露，達(dá)到修復(fù)的目的[17]。本研究使用高壓修復(fù)后經(jīng)胃蛋白酶消化，可使組織表白中細(xì)胞排列密集，特別是出現(xiàn)重疊的細(xì)胞經(jīng)消化后出現(xiàn)更多裸核的效果，但該方法必須嚴(yán)格掌握胃蛋白酶的工作濃度和工作時間，否則出現(xiàn)細(xì)胞消化過度，細(xì)胞出現(xiàn)空泡的現(xiàn)象實(shí)驗(yàn)即宣告失敗。故活檢組織需在消化前在顯微鏡下觀察標(biāo)本形態(tài)以調(diào)節(jié)消化的時間和濃度，靈活掌握。另不同實(shí)驗(yàn)室組織的消化時間也不會完全一致，應(yīng)自行摸索消化最佳時間。但該組玻片經(jīng)Feulgen染色后效果最佳，染色均一，細(xì)胞核平層不破裂，紅細(xì)胞較少，進(jìn)行后期DNA倍體分析后得到最穩(wěn)定可靠的分析數(shù)據(jù)。

C組（石蠟組織制備細(xì)胞懸液法）制作的片子細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，膠原消化液消化黏液，低滲液破壞紅細(xì)胞，玻片背景較干凈， 但部分區(qū)域有重疊凝集現(xiàn)象，部分腺上皮細(xì)胞出現(xiàn)皺縮情況。該組手工滴片穩(wěn)定性較差，操作步驟較A、B組稍多。因膠原消化液為進(jìn)口試劑，臨床使用需增加科室制片成本。該組特點(diǎn)是可完全消除紅細(xì)胞，樣本上細(xì)胞量可根據(jù)滴片時的肉眼所見自行掌握，并可反復(fù)制作多張玻片。

綜上所述，B組（常規(guī)制片脫蠟酶消法）制片方法可用于乳腺疾病石蠟切片的DNA倍體分析，我們進(jìn)一步的研究將探討從正常乳腺組織到乳腺癌進(jìn)程中DNA倍體改變情況以及這種改變在腫瘤組織分化中起到的作用，為乳腺癌前病變與乳腺癌發(fā)生的臨床診療提供一個新的思路。

4 致謝

感謝科主任和同事們在本文實(shí)驗(yàn)過程中給予的指導(dǎo)，這篇論文的每個實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)和每個數(shù)據(jù)，都離不開同事們的幫助。

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（收稿日期：2013-01-08）