膽紅素對(duì)內(nèi)毒素致急性肺損傷大鼠水通道蛋白1、5表達(dá)的影響

[摘要] 目的 探討膽紅素對(duì)脂多糖所致急性肺損傷大鼠的水通道蛋白1、5是否存在調(diào)節(jié)作用，探討其保護(hù)作用機(jī)制。 方法 雄性Wistar大鼠18只，隨機(jī)分為生理鹽水對(duì)照組（C組）、脂多糖模型組（L組）和膽紅素預(yù)處理組（B組），每組各6只。每組于造模后4 h處死大鼠。測(cè)定每組肺濕/干重比值，ELISA法測(cè)血清中IL-8含量，肺組織中cAMP含量，免疫組化法測(cè)定每組水通道蛋白1、5的表達(dá)變化，觀察各組肺組織病理改變。 結(jié)果 與模型組（L組）比較，膽紅素干預(yù)組（B組）的W/D值下降，IL-8含量明顯降低，cAMP含量表達(dá)上升（P < 0.05），水通道蛋白1、5表達(dá)增強(qiáng)（P < 0.05），肺水腫病理改變明顯減輕。 結(jié)論 膽紅素可能是通過(guò)cAMP信號(hào)途徑調(diào)節(jié)水通道蛋白1、5表達(dá)改善水代謝，減輕肺水腫狀態(tài)，從而對(duì)急性肺損傷具有保護(hù)作用。

[關(guān)鍵詞] 急性肺損傷；膽紅素；水通道蛋白1；水通道蛋白5；大鼠；肺水腫

[中圖分類(lèi)號(hào)] R965.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 1673-9701（2013）14-0003-04

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是各種直接和間接致傷因素導(dǎo)致的肺泡上皮細(xì)胞及毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，造成彌漫性肺間質(zhì)及肺泡水腫，導(dǎo)致急性低氧性呼吸功能不全。但近年來(lái)人們對(duì)急性肺損傷的發(fā)病機(jī)制仍不十分清楚，尋找有效的防治措施是目前研究的熱點(diǎn)。內(nèi)毒素所致的急性肺損傷，其主要病理特征為血管通透性增高的肺水腫，表現(xiàn)為肺組織腫脹，組織間隙內(nèi)大量液體集聚，肺水腫的嚴(yán)重程度與急性肺損傷的預(yù)后相關(guān)，因此改善急性肺損傷所引起的肺水腫具有非常重要的臨床意義[1]。水通道蛋白（AQPs）是一種家族性的膜運(yùn)輸?shù)鞍祝ㄟ^(guò)脂質(zhì)雙分子層形成水通道，滲透性地驅(qū)動(dòng)水分子在細(xì)胞膜跨越運(yùn)輸[2]。發(fā)生急性肺損傷后AQPs表達(dá)會(huì)下降，使機(jī)體清除過(guò)多水腫液的能力下降，導(dǎo)致過(guò)多液體在肺泡間質(zhì)聚積，從而加重肺泡和間質(zhì)內(nèi)水腫[3]。由此可見(jiàn)，AQPs 在肺水腫的形成和消除過(guò)程中起非常重要的作用。

以往人們認(rèn)為膽紅素是一種有毒的血紅素終末代謝產(chǎn)物，隨著對(duì)其研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)膽紅素具有極強(qiáng)的抗氧化、抗炎、抗細(xì)胞凋亡的能力，對(duì)急性肺損傷具有一定的保護(hù)作用[4]，但其具體作用機(jī)制仍不完全清楚，膽紅素對(duì)急性肺損傷的保護(hù)機(jī)制是否與通過(guò)調(diào)節(jié)水通道蛋白（AQPs）有關(guān)。我們通過(guò)膽紅素干預(yù)內(nèi)毒素誘導(dǎo)的急性肺損傷大鼠，檢測(cè)大鼠體內(nèi)IL-8、cAMP、水通道蛋白1、5的表達(dá)，探討膽紅素在急性肺損傷中與水通道蛋白的關(guān)系，是否通過(guò)cAMP途徑調(diào)節(jié)水通道蛋白（AQPs），從而完善其具體保護(hù)機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 動(dòng)物、藥物與主要試劑

雄性Wister大鼠18只，（體重200～250 g）購(gòu)自中國(guó)軍事科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，LPS（Sigma公司），膽紅素（英國(guó)Frontier scientific公司），IL-8酶聯(lián)免疫吸附試劑盒（上海西塘科技公司），cAMP酶聯(lián)免疫吸附試劑盒（上海西塘科技公司），AQP-1一抗，AQP-5一抗（美國(guó)Abcam公司）。

1.2 模型的制備及分組

雄性Wister大鼠18只，隨機(jī)分為三組，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，分組情況如下：①生理鹽水對(duì)照組（C組），尾靜脈注射生理鹽水（2 mL/kg 體重）；②脂多糖模型組（L組），尾靜脈注射LPS（5 mg/kg 體重）；膽紅素預(yù)處理組（B組），膽紅素連續(xù)灌胃6 d（40 mg/kg 體重），每天上午1次，第6次灌胃后1h尾靜脈注射LPS。每組均于造模后4 h處死大鼠收集標(biāo)本。

1.3檢測(cè)指標(biāo)與方法

戊巴比妥麻醉固定后，腹主動(dòng)脈取血5 mL，分離血清保存于-70℃用于測(cè)定IL-8。肺濕/干重比，取右肺中葉，稱(chēng)量濕重量后，置于80℃烤箱，72 h至恒重后測(cè)量干重，計(jì)算W/D。取右肺上葉肺組織，給予10%甲醛固定，石蠟包埋切片后，進(jìn)行HE染色，于普通光學(xué)顯微鏡下觀察病理組織。取右肺下葉，研磨肺組織勻漿，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定肺組織中cAMP含量。肺組織免疫組織化學(xué)：右肺上葉組織石蠟包埋切片，用SP法檢測(cè)AQP-1，AQP-5在肺內(nèi)的蛋白表達(dá)。常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，過(guò)氧化氫封閉5～10 min，PBS洗3次，每次5 min。高壓抗原修復(fù)后，冷卻至室溫。正常山羊血清工作液封閉30 min，滴加AQP-1一抗（抗體濃度1：100），AQP-5一抗（抗體濃度1：200）4℃過(guò)夜后，PBS洗3次，每次5 min，AQP-5滴加生物素化羊抗兔IgG，AQP-1滴加生物素羊抗小鼠IgG，室溫，30 min；DAB反應(yīng)染色，自來(lái)水沖洗后，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水，透明，干燥，封片。陰性對(duì)照以PBS緩沖液作為一抗。染色結(jié)果圖像分析以肺組織中出現(xiàn)明確的棕黃色或棕褐色顆粒可判定為陽(yáng)性結(jié)果。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，應(yīng)用BI-2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)檢測(cè)AQP-1，AQP-5的光密度值。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有計(jì)量數(shù)據(jù)均以（x±s）表示，采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，均數(shù)間比較采用單因素方差分析（ANOVA）。多個(gè)樣本均數(shù)間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，取α=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1動(dòng)物的一般情況

C組大鼠精神狀況和反映良好，毛發(fā)整齊，抓取會(huì)逃避，活動(dòng)自如。L組大鼠出現(xiàn)呼吸急促，蜷縮成團(tuán)，毛發(fā)豎立，精神萎靡不振，排稀便。B組癥狀與L組癥狀相似，但嚴(yán)重程度較之減輕。

2.2 大鼠肺W/D值變化

L組W/D比值明顯高于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P <0.05），B組較L組W/D比值降低，但仍高于C組（P < 0.05）。

2.3大鼠肺組織病理學(xué)改變

C組無(wú)明顯炎癥變化，L組光鏡下可見(jiàn)不同程度的肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺泡間隔明顯增寬，肺泡腔及間質(zhì)內(nèi)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺間質(zhì)水腫，肺泡腔內(nèi)有滲出液，有透明膜形成，局部出現(xiàn)肺不張，肺萎陷。B組肺水腫程度減輕，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，肺泡腔無(wú)明顯滲出。見(jiàn)圖1。

2.4 血清中IL-8，肺組織中cAMP含量

與C組比較L組IL-8含量明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。B組IL-8含量較LPS組減少，但仍高于C組，其與其他兩組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。L組與C組比較cAMP含量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），B組cAMP含量較L組增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），但仍低于C組（P < 0.05）。見(jiàn)表1。

2.5 AQP-1，AQP-5表達(dá)的變化免疫組化結(jié)果

正常肺組織中肺泡周?chē)椭夤苤車(chē)拿?xì)血管內(nèi)皮及肺泡上皮均有 AQP-1 陽(yáng)性染色（棕黃色），LPS組4 h后在毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞AQP-1表達(dá)明顯下降（P < 0.05），這種減少在全肺均能看到，并非完全局限在損傷嚴(yán)重的部位。B組AQP-1表達(dá)明顯上調(diào)，但與C組之間比較無(wú)顯著差異（P > 0.05）。正常肺組織中氣道上皮細(xì)胞和I型肺泡上皮細(xì)胞也可見(jiàn)AQP-5陽(yáng)性染色（棕黃色），LPS組4 h后在正常肺組織中氣道上皮細(xì)胞和I型肺泡上皮細(xì)胞明顯減少（P < 0.05），而且這種減少是均一分布，并不是單純發(fā)生在炎癥反應(yīng)中，上皮細(xì)胞脫落多的地方，B組AQP-5表達(dá)明顯上升，但與C組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見(jiàn)表1。

3討論

急性肺損傷（ALI）是指由心源性以外的各種肺內(nèi)外致病因素所導(dǎo)致的急性缺氧性呼吸衰竭。在一些病理?xiàng)l件下如：呼吸窘迫綜合癥、充血性心力衰竭，病毒感染等因素刺激時(shí)，使肺的水液平衡遭到破壞，肺的液體運(yùn)輸受到影響，從而導(dǎo)致肺水腫[5]。急性肺損傷（ALI）是以肺水腫為主要特征的一種臨床綜合征，急性肺損傷的病理變化之一就是肺水腫。但目前對(duì)肺水腫的發(fā)病機(jī)制仍不完全清楚，以往人們認(rèn)為，肺水腫主要是肺泡上皮/微血管內(nèi)皮屏障功能失調(diào)及肺泡液體間隙受損所致，而對(duì)存在水通道蛋白（AQPs）調(diào)節(jié)肺水的轉(zhuǎn)運(yùn)、維持肺液平衡的作用卻認(rèn)識(shí)不足。

水通道蛋白（AQPs）是一組與水的通透性有關(guān)的細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白， AQPs不僅在肺組織中快速控制水的轉(zhuǎn)運(yùn)，而且在機(jī)體其他組織中也發(fā)揮水的新陳代謝的基礎(chǔ)作用。在分子水平上揭示了水跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)的基本機(jī)制[6]。肺水腫是以肺泡和肺間質(zhì)內(nèi)過(guò)多液體積聚為特點(diǎn)。發(fā)生時(shí)必然伴有液水平衡破壞，水通道蛋白功能的改變，因此充分認(rèn)識(shí)到水通道蛋白對(duì)肺臟的作用為臨床治療肺水腫提供重要的依據(jù)。

AQPs是一類(lèi)可調(diào)節(jié)水進(jìn)出細(xì)胞膜的水通道同源蛋白家族的總稱(chēng)。在哺乳動(dòng)物體內(nèi)目前已被發(fā)現(xiàn)的有13種（AQP-0～AQP-12），AQPs在許多組織均有表達(dá)，如腎、眼、肺等，分布于肺組織中的AQPs有6種（AQP-1、AQP-3、 AQP-4、AQP-5、AQP-8、AQP-9）[7]。其中AQP-1定位于微血管內(nèi)皮、支氣管周?chē)难堋獾鲤つど掀ず托啬?，肺泡Ⅱ型上皮?xì)胞亦有少量的分布。AQP-5主要發(fā)現(xiàn)在肺泡Ⅰ型細(xì)胞的頂膜面及氣道分泌腺細(xì)胞上[8]。AQP-1、5只負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)水，不允許其他溶質(zhì)和分子通過(guò)。AQP-1和AQP-5的作用環(huán)節(jié)并不完全一致，AQP-1主要負(fù)責(zé)清除支氣管和脈管周?chē)慕M織的水分，而AQP-5則是清除肺泡腔內(nèi)的水分[9]。在小鼠肺部遭受病毒感染誘導(dǎo)急性肺損傷引起肺水腫的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，觀察到小鼠肺內(nèi)AQP-1和AQP-5的mRNA和蛋白表達(dá)量均有下降，但在肺部炎癥開(kāi)始減輕后有所恢復(fù)[10]。有實(shí)驗(yàn)證明，在肺泡內(nèi)灌注脂多糖4～12 h后可出現(xiàn)明顯的肺水腫病理變化，AQP-1和AQP-5蛋白表達(dá)明顯減少，傷后12 h肺水腫表現(xiàn)開(kāi)始減輕，同時(shí)發(fā)現(xiàn)微血管內(nèi)皮細(xì)胞AQP-1的表達(dá)量也有部分上升[11]，但AQP-5的含量未見(jiàn)恢復(fù)，說(shuō)明AQP-5蛋白減少的持續(xù)時(shí)間超過(guò)AQP-1，可見(jiàn)AQP-5和AQP-1在結(jié)構(gòu)和功能上存在一定差異。因此可通過(guò)提高AQP-1和AQP-5的表達(dá)或活性，增加肺水腫患者的肺水清除率，可能是治療肺水腫的一種有效途徑，也為臨床急性肺損傷的治療提供了新的思路[12]。

cAMP-PKA途徑是細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要途徑，激動(dòng)信號(hào)與G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合后導(dǎo)致受體構(gòu)象改變，由G蛋白偶聯(lián)受體（Gi或Gs）將信號(hào)首先傳至腺苷酸環(huán)化酶（AC），AC可利用ATP生成cAMP，由其控制cAMP的含量，cAMP決定蛋白激酶A（PKA）的活性，蛋白激酶A負(fù)責(zé)很多蛋白的磷酸化，被磷酸化的靶蛋白往往是調(diào)節(jié)酶或重要功能蛋白，因而可以介導(dǎo)細(xì)胞外信號(hào)，調(diào)節(jié)細(xì)胞反應(yīng)。在水通道的調(diào)節(jié)中，磷酸化是一個(gè)非常重要的過(guò)程，AQP-1，AQP-5均含有PKA和PKC的同源序列，且受磷酸化作用直接調(diào)節(jié)，AQP的磷酸化為cAMP依賴性，在某些刺激因素作用下，腺苷環(huán)化酶（AC）被激活，使細(xì)胞內(nèi)cAMP增加，進(jìn)一步活化PKA或PKC，使其催化AQP上的絲氨酸磷酸化，從而增加細(xì)胞膜對(duì)水的通透性[13]。cAMP是細(xì)胞內(nèi)的重要信使之一，在跨膜細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起細(xì)胞內(nèi)信息傳遞作用。在急性肺損傷引起的肺水腫中，可提高cAMP的水平，使其通過(guò)信號(hào)傳導(dǎo)途徑上調(diào)肺泡上皮細(xì)胞的鈉水通道及鈉泵功能，提高肺水清除率，增加血管外肺水的吸收[14]。

傳統(tǒng)觀念認(rèn)為膽紅素是人體內(nèi)的一種有害代謝產(chǎn)物，臨床上將血中膽紅素含量作為肝、膽、胰疾病嚴(yán)重程度的診斷指標(biāo)之一。但是隨著近年來(lái)血紅素加氧酶（HO）/一氧化碳-膽紅素系統(tǒng)研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)對(duì)膽紅素的認(rèn)識(shí)并不全面。大量實(shí)驗(yàn)研究表明，膽紅素作為一種內(nèi)源性抗氧化劑，具有極強(qiáng)的抗氧化、廣泛的非特異性抗炎作用及抑制細(xì)胞凋亡的能力[15]。在急性肺損傷的發(fā)病過(guò)程中，膽紅素可發(fā)揮抗氧化作用，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化物損傷，減少體內(nèi)抗氧化酶的消耗，減輕內(nèi)毒素所致的急性肺損傷[16]。膽紅素可以抑制由脂多糖引起的內(nèi)皮細(xì)胞NF-κB從胞漿到胞核的移位，減少相關(guān)的炎癥蛋白基因轉(zhuǎn)錄，幫助中性粒細(xì)胞趨化，使局部炎癥介質(zhì)產(chǎn)生減少，從而減輕肺組織炎癥[17]。同時(shí)膽紅素可以對(duì)抗氧自由基引發(fā)的細(xì)胞凋亡的作用，在大鼠急性肺損傷中，caspase-3的表達(dá)降低，肺內(nèi)凋亡細(xì)胞數(shù)量減少，而caspase-3表達(dá)的降低可能是NF-κB的活性受到抑制的結(jié)果[18]。膽紅素通過(guò)抗炎、抗氧化、抗細(xì)胞凋亡等途徑對(duì)急性肺損傷起到保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，尾靜脈注射脂多糖引起大鼠急性肺損傷后病理改變?yōu)榉闻萁Y(jié)構(gòu)破壞，肺泡腔及間質(zhì)內(nèi)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺間質(zhì)水腫，W/D比值增加，血清中IL-8含量升高，提示ALI造模成功，肺組織中cAMP含量明顯下降，肺組織中AQP-1，AQP-5表達(dá)明顯減少。膽紅素對(duì)其預(yù)處理后，大鼠肺組織病理?yè)p傷程度減輕，W/D，IL-8指標(biāo)有所下降，但仍高于對(duì)照組，cAMP含量上升，AQP-1，AQP-5在肺組織中表達(dá)上調(diào)。表明膽紅素可能是通過(guò)cAMP信號(hào)途徑來(lái)調(diào)節(jié)AQP-1，AQP-5的表達(dá)。膽紅素通過(guò)上調(diào)AQP-1，AQP-5的蛋白表達(dá)，提高肺水清除率，減輕肺水腫的嚴(yán)重程度，從而對(duì)急性肺損傷起到一定的保護(hù)作用。

肺的水液代謝與水通道蛋白密切相關(guān)，但膽紅素對(duì) AQPs 的調(diào)節(jié)作用未見(jiàn)報(bào)道。我們采用內(nèi)毒素誘發(fā) ALI 大鼠模型，觀察膽紅素對(duì)肺水通道蛋白-1（AQP-1）、水通道蛋白-5 （AQP-5）的表達(dá)及其病理改變的影響，從而進(jìn)一步完善膽紅素對(duì)急性肺損傷具體保護(hù)機(jī)制，為膽紅素藥理效應(yīng)提供新的依據(jù)。但其對(duì)ALI/ARDS的其他作用和機(jī)制還有待于更進(jìn)一步的研究。

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（收稿日期：2013-02-26）