外源性EPO對內(nèi)毒素誘導(dǎo)心肌損傷的保護(hù)及其機制研究

[摘要] 目的 觀察促紅細(xì)胞生成素（EPO）對內(nèi)毒素誘導(dǎo)心肌損傷的保護(hù)作用及可能的機制。 方法 成功復(fù)制內(nèi)毒素心肌損傷模型后采用隨機數(shù)字表法將30只大鼠分為假手術(shù)組、膿毒癥組和EPO干預(yù)組，每組隨機分配10只大鼠。假手術(shù)組開腹后找到盲腸后縫合腹壁切口，不穿刺盲腸；膿毒癥組行盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)；EPO干預(yù)組于模型復(fù)制后給予EPO腹腔注射1000 U/kg。采用酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）法測定心肌損傷標(biāo)志物（cTnI、CK、CK-MB）含量和腫瘤壞死因子（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）水平。 結(jié)果 膿毒癥組大鼠血清心肌損傷標(biāo)志物（cTnI、CK、CK-MB）水平顯著高于假手術(shù)組，相比較有顯著性差異（t = 4.961、4.798、3.038，P < 0.05）；經(jīng)EPO干預(yù)后，EPO干預(yù)組大鼠血清心肌損傷標(biāo)志物（cTnI、CK、CK-MB）水平顯著降低，與膿毒癥組比較有顯著性差異（t = 6.631、5.785、3.931，P < 0.05）。膿毒癥組大鼠血清TNF-α、IL-6水平顯著高于假手術(shù)組，相比較有顯著性差異（t = 6.744、7.883，P < 0.05）；經(jīng)EPO干預(yù)后，EPO干預(yù)組大鼠血清TNF-α、IL-6水平顯著降低，與膿毒癥組比較有顯著性差異（t = 4.276、7.180，P < 0.05）。 結(jié)論 EPO可能通過抑制TNF-α、IL-6的分泌和對心肌細(xì)胞的保護(hù)效應(yīng)來達(dá)到減輕大鼠內(nèi)毒素誘導(dǎo)的心肌損傷，從而起到保護(hù)作用。

[關(guān)鍵詞] 膿毒癥；心肌損傷；促紅細(xì)胞生成素；動物模型

[中圖分類號] R541 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2013）25-0004-03

A study on the protection function and mechanism of exogenous EPO on endotoxin-induced myocardial injury

JIN Wenyang SUN Wei CHEN Jianping

Emergency Department， Taizhou Hospital， Enze Medical Center， Linhai 317000， China

[Abstract] Objective To observe the protection function of EPO on endotoxin-induced myocardial injury and its possible mechanism. Methods After successful replication of endotoxin myocardial damage model， 30 rats were divided into sham operation group， sepsis group and EPO intervention group through random numerical table method. 10 rats were randomly distributed to each group. For the sham operation group， the incision was sutured after the cecum was found， and the cecum was not punctured； for the sepsis group， cecum ligation and perforation were carried out； for EPO intervention group， intraperitoneal injection of EPO was carried out by 1000 U/kg. The myocardial injury markers （cTnI， CK， CK-MB） content， tumor necrosis factor （TNF-α） and interleukin-6 （IL-6） level were measured through enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）. Results Rats serum myocardial injury markers levels （cTnI， CK， CK-MB） of the sepsis group were obviously higher than those of the sham operation group， the difference of which was great （t = 4.961， 4.798， 3.038， P < 0.05）； after EPO intervention， the serum myocardial injury markers levels for the EPO intervention group were significantly reduced， and its comparison with the sepsis group was significantly different （t = 6.631， 5.785， 3.931， P < 0.05）. The serum levels of TNF-α and IL-6 were significantly higher than those of the sham operation group； their comparison were significantly different （t = 6.744， 7.883， P < 0.05）； after EPO intervention， the serum levels of TNF-α and IL-6 for the EPO intervention group were significantly reduced， and its comparison with the sepsis group was significantly different （t = 4.276， 7.180， P < 0.05）. Conclusion EPO can reduce endotoxin-induced myocardial injury through restraining the secretion of TNF-α and IL-6 and the protection of cardiac cells， thus achieving the effects of protection.

[Key words] Sepsis； Myocardial injury； Erythropoietin； Animal models

膿毒癥是指由感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS），也是機體發(fā)生多臟器功能障礙綜合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）的重要原因之一[1]。細(xì)菌產(chǎn)生的內(nèi)毒素釋放入血是膿毒癥發(fā)生的關(guān)鍵，內(nèi)毒素可誘導(dǎo)機體出現(xiàn)全身炎癥反應(yīng)綜合征從而造成多臟器損傷，特別是引起心肌抑制和心肌損傷，而目前對于膿毒癥心肌抑制和心肌損傷尚無有效的治療方法。促紅細(xì)胞生成素（erythropoietin，EPO）是一種糖蛋白造血細(xì)胞生長因子，主要由人體中的腎小管周圍毛細(xì)血管床的間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生，EPO與促紅細(xì)胞生成素受體（EPOR）結(jié)合調(diào)控紅系干細(xì)胞增殖、分化、成熟，促進(jìn)網(wǎng)織紅細(xì)胞釋放入血的生物學(xué)作用。隨著對EPO研究的深入，發(fā)現(xiàn)EPO具有促血管生成作用和細(xì)胞保護(hù)功能，并證明EPO對急慢性心肌細(xì)胞損傷發(fā)揮著一定的保護(hù)作用[2]。此外，EPO用于脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的內(nèi)毒素小鼠，可降低死亡率，并對肝、脾、淋巴、肺具有保護(hù)作用[3]。因此，本研究于2012年2～3月間通過建立大鼠內(nèi)毒素心肌損傷模型，觀察EPO對內(nèi)毒素心肌損傷的保護(hù)作用，并探討其可能的保護(hù)機制。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

注射用重組人促紅細(xì)胞生成素（recombinant human erythropoietin，rHuEPO）3 000 IU/支，購自上海凱茂生物醫(yī)藥有限公司，產(chǎn)品批號：S20050090。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS，L2880）、3-去氮腺苷（3-deazaadenosine）均為Sigma公司產(chǎn)品，cTnI ELISA試劑盒、CK ELISA試劑盒、CK-MB ELISA試劑盒、IL-6 ELISA試劑盒、TNF-α ELISA試劑盒均購自武漢華美生物工程有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純，水為去離子水。

1.2 實驗動物與分組

健康雄性SD大鼠（300～320 g）（SPF級，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供）30只，按清潔級大鼠的要求標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)。根據(jù)實驗設(shè)計，大鼠腹腔注射生理鹽水，連續(xù)處理3 d后腹腔注射LPS 10 mg/kg，成功復(fù)制內(nèi)毒素心肌損傷模型[4]后采用隨機數(shù)字表法將30只大鼠分為膿毒癥組、假手術(shù)組和EPO干預(yù)組，每組隨機分配10只大鼠。

1.3 動物模型的建立

膿毒癥組：以10%水合氯醛0.03 mL/kg皮下注射麻醉大鼠后仰臥固定于手術(shù)板上，取腹部正中切口，顯露盲腸并在其根部約1.5 cm結(jié)扎，用18號針穿刺盲腸3次，留置橡皮引流條防止針孔閉合，擠壓盲腸致糞便溢出，確認(rèn)盲腸漏后，盲腸還納腹腔，逐層縫合腹壁切口關(guān)腹。EPO干預(yù)組：內(nèi)毒素心肌損傷模型復(fù)制后立即給予EPO腹腔注射1 000 U/kg，其余操作同膿毒癥組。假手術(shù)組：打開腹腔找到盲腸后縫合腹壁切口，不穿刺盲腸，其余操作同膿毒癥組。

1.4 觀察指標(biāo)

盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)后12 h經(jīng)下腔靜脈穿刺取血5 mL，低溫3 000 r/min離心15 min分取血清，置-20℃冰箱保存?zhèn)溆么郎y，包括：心肌肌鈣蛋白I（cTnI）、肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、腫瘤壞死因子（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）含量。上述指標(biāo)均采用ELISA方法進(jìn)行檢測，檢測方法嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，先采用F檢驗對各組檢測結(jié)果進(jìn)行分析，各組均數(shù)間兩兩比較采用t檢驗，P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組心肌損傷標(biāo)志物水平檢測結(jié)果

膿毒癥組大鼠血清心肌損傷標(biāo)志物（cTnI、CK、CK-MB）水平顯著高于假手術(shù)組，相比較有顯著性差異（t = 4.961、4.798、3.038，P < 0.05）；經(jīng)EPO干預(yù)后，EPO干預(yù)組大鼠血清心肌損傷標(biāo)志物（cTnI、CK、CK-MB）水平顯著降低，與膿毒癥組比較有顯著性差異（t = 6.631、5.785、3.931，P < 0.05）。見表1。

表1 各組心肌損傷標(biāo)志物水平檢測結(jié)果（x±s）

注：三組間心肌損傷標(biāo)志物水平比較，P < 0.01

2.2 各組大鼠血清TNF-α、IL-6水平檢測結(jié)果

膿毒癥組大鼠血清TNF-α、IL-6水平顯著高于假手術(shù)組，相比較有顯著性差異（t = 6.744、7.883，P < 0.05）；經(jīng)EPO干預(yù)后，EPO干預(yù)組大鼠血清TNF-α、IL-6水平顯著降低，與膿毒癥組比較有顯著性差異（t = 4.276、7.180，P < 0.05）。見表2。

表2 各組大鼠血清TNF-α、IL-6水平檢測結(jié)果（x±s，ng/L）

注：三組間血清TNF-α、IL-6水平比較，P < 0.01

3 討論

膿毒癥病情進(jìn)展迅速、臨床救治困難，我國膿毒癥患者的死亡率居高不下，大約為20%～40%，是危重癥患者死亡的首要原因，并發(fā)心肌損害更嚴(yán)重影響膿毒癥患者的預(yù)后，一般認(rèn)為心肌損害是嚴(yán)重膿毒癥的主要死因[5]。而防治內(nèi)毒素性心肌損傷對降低膿毒癥患者的死亡率具有十分重要的意義。

人類EPO基因由166個氨基酸殘基組成，定位于7號染色體長臂22區(qū)（7q22），體內(nèi)EPO主要由低氧誘導(dǎo)產(chǎn)生，腎臟分泌入循環(huán)。EPO的作用是維持紅細(xì)胞造血前體細(xì)胞的存活并促進(jìn)其分裂，誘導(dǎo)晚期紅系祖細(xì)胞生長成為成熟的紅細(xì)胞[6]。EPO促進(jìn)紅細(xì)胞生成的生物學(xué)效應(yīng)主要是通過位于骨髓紅系祖細(xì)胞表面的特異性EPO受體來完成的，EPO及EPO受體結(jié)合發(fā)揮生物活性，激活多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑發(fā)揮抗凋亡作用[7]。據(jù)研究報道[8]，EPO及EPO受體的高表達(dá)可能與多種惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展、新生血管生成有著密切的關(guān)系；此外，EPO及EPO受體信號途徑在生理及病理的促進(jìn)心、腦損傷修復(fù)等多方面起重要作用[9]。近年來，EPO參與胚胎的正常發(fā)育、促進(jìn)血管生成、組織保護(hù)作用、抑制炎癥反應(yīng)、抗氧化及對心肌的作用等多種非造血生物作用成為研究的熱點。目前臨床上主要用EPO治療腎性貧血及腫瘤等各種慢性疾病所導(dǎo)致的貧血[10]，并發(fā)現(xiàn)外源性EPO可以降低LPS誘導(dǎo)的內(nèi)毒素小鼠的死亡率，并對肝、脾、淋巴、肺具有保護(hù)作用[3]。

cTnI、CK、CK-MB是反映心肌細(xì)胞損傷較為敏感的指標(biāo)。當(dāng)心肌細(xì)胞因缺血、缺氧等因素發(fā)生變性壞死，cTnI外漏并通過受損的細(xì)胞膜彌散進(jìn)入細(xì)胞間質(zhì)，隨之進(jìn)入血管引起血清cTnI的升高[11]。cTnI對心肌損傷具有高度特異性，是反映心肌損傷程度高敏感高特異的指標(biāo)之一。CK-MB是一種細(xì)胞內(nèi)酶，當(dāng)心肌缺血或者再灌注損傷時，細(xì)胞膜通透性升高導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的CK、CK-MB大量入血[12]。特別是CK和CK-MB可以特異性地反映心肌細(xì)胞受損程度，血清中CK和CK-MB越高，則表明心肌受損越嚴(yán)重。本研究也證實在膿毒癥狀態(tài)下cTnI、CK、CK-MB顯著增高，cTnI、CK、CK-MB升高提示當(dāng)機體發(fā)生膿毒癥時存在著心肌損傷。在應(yīng)用EPO干預(yù)后，cTnI、CK、CK-MB水平顯著下降，進(jìn)一步說明EPO在膿毒癥大鼠心肌損傷中具有保護(hù)作用。

炎癥細(xì)胞因子的觸發(fā)、增強和放大是膿毒癥病理變化的核心之一，炎癥細(xì)胞因子在膿毒癥的發(fā)生和發(fā)展過程中起著非常重要的作用，影響著膿毒癥的發(fā)展方向。當(dāng)機體內(nèi)抗炎細(xì)胞因子濃度過高時，發(fā)生嚴(yán)重的免疫抑制，導(dǎo)致感染加重和器官功能受損；而當(dāng)促炎細(xì)胞因子濃度增高時，則全身炎癥反應(yīng)失衡，引起器官功能的損傷和衰竭[13]。TNF-α、IL-6是重要的促炎細(xì)胞因子，在膿毒癥的早期由組織細(xì)胞合成與分泌，是機體炎癥反應(yīng)發(fā)生的關(guān)鍵早期啟動因子，對激發(fā)炎癥反應(yīng)的“瀑布效應(yīng)”具有重要作用[14]。因此觀察TNF-α、IL-6水平變化對膿毒癥患者的預(yù)后判斷有著重要的臨床意義。本研究結(jié)果顯示，盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)后12 h，膿毒癥組血清TNF-α、IL-6水平均顯著高于假手術(shù)組，提示在膿毒癥的發(fā)生和發(fā)展過程中細(xì)胞因子過多地釋放，膿毒癥機體存在過度的炎癥反應(yīng)。而經(jīng)EPO干預(yù)后血清TNF-α、IL-6水平顯著下降，提示EPO作為一種抗炎物質(zhì)，可以有效抑制促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-6的釋放，抑制組織器官炎癥反應(yīng)及其引起的病理損害，以達(dá)到保護(hù)心肌的作用。

綜上所述，EPO可能通過抑制TNF-α、IL-6的分泌和對心肌細(xì)胞的保護(hù)效應(yīng)來達(dá)到減輕大鼠內(nèi)毒素誘導(dǎo)的心肌損傷，從而起到保護(hù)作用。這為外源性EPO治療膿毒癥提供了新的思路。然而，EPO非造血生物活性的確切機制尚未明確，有關(guān)外源性EPO的作用信號通路還有待于進(jìn)一步深入研究。

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（收稿日期：2013-05-15）