生姜拮抗性內(nèi)生細菌的篩選

摘 要：從樂山市售生姜根狀莖中分離純化內(nèi)生細菌，并以金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）、大腸桿菌 （Escherichia coli （E.coli））、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Methicillin-resistant staphylococcus aureus，MRSA）為靶標菌進行抑菌試驗。研究結(jié)果表明：生姜中存在大量的內(nèi)生細菌，分離獲得的9個菌株對四種靶標菌都有不同程度的抑菌作用，2個菌株（SJ1 and SJ9）抑菌效果非常顯著，相對抑菌率超過170%。

關鍵詞：生姜 內(nèi)生細菌 分離 拮抗作用 篩選

中圖分類號：S476 文獻標識碼：A 文章編號：1672-3791（2013）04（c）-0154-03

生姜（Zingiber officinale Roscoe）在中藥中是一種很重要的藥用植物，由于其性辛辣的特點，有發(fā)汗、驅(qū)寒、止嘔、解毒等多種功能[1]，生姜中的一些代謝產(chǎn)物還具有良好的降膽固醇、抑菌、抗衰老、抗癌、防血凝、抗氧化及防腐等作用，如姜黃、姜精油[2]。生姜內(nèi)生細菌是指存在于生姜組織和器官內(nèi)部的細菌，根據(jù)相似相溶原理，生姜內(nèi)生細菌可能具有生姜相同的抑菌效果[3]，可作為重要的天然抑菌材料來源進行研究。

由于生姜的病變很少，本研究基于生姜內(nèi)生細菌可能具有抑菌功效的思想，從生姜組織中分離純化內(nèi)生細菌，并篩選對金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）、大腸桿菌 （Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Methicillin-resistant staphylococcus aureus，MRSA）有抑菌作用的菌株，為利用植物內(nèi)生細菌資源開發(fā)抑菌新藥物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

從樂山各市場購買市售食用生姜。

1.2 靶標菌

S.aureus、E.coli、B.subtilis、MRSA，由本校病理實驗室提供。

1.3 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（分離純化培養(yǎng)基）：馬鈴薯200 g，葡萄糖5 g，瓊脂粉16 g，純凈水1000 ml，pH自然[4]。

馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基（PDA）（拮抗篩選培養(yǎng)基）：馬鈴薯200 g，削皮煮汁，葡萄糖5 g，瓊脂粉20 g，水1000 ml，pH7.0[5]。

1.4 生姜內(nèi)生菌的分離純化

生姜的表面消毒：取無病無霉變的完整生姜塊根（約30 g），用自來水沖洗5 min，沖洗表面的泥土等污物，放于已滅菌的培養(yǎng)皿中，無菌水反復沖洗3～5次，5%次氯酸鈉洗滌3次，無菌水沖洗3～5次，收集最后一次沖洗液做無菌檢驗[6]。

分離純化：在無菌條件下，分別用滅菌后的解剖刀切割表面消毒完全的生姜塊根成直徑為0.5 cm方形的小塊，用無菌鑷子將姜塊放于馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基上不同的地方，每個平板均勻擺放3～4塊，置于28 ℃培養(yǎng)，每隔12 h觀察一次，培養(yǎng)2～3 d時間。待培養(yǎng)皿上出現(xiàn)單菌落時，根據(jù)菌落的形態(tài)、顏色、大小將其分類后采用平板劃線法接種到新鮮平板上培養(yǎng)，直到獲得單菌落為止[7～8]，純化后的菌株保存于斜面中備用。

1.5 平板對峙法初篩

內(nèi)生細菌活化后涂布接種在平板上培養(yǎng)24 h后，在無菌條件下用0.5 cm打孔器制打成菌餅[9～10]，將菌餅放置于涂布接種有四種靶標菌的平板上，28 ℃培養(yǎng)，每隔12 h觀察一次，培養(yǎng)48 h后用十字交叉法測定抑菌圈的大小[11～12]，每處理重復三次，以無菌的培養(yǎng)基打孔代替菌餅做為對照（CK）[13]。相對抑菌率（%）=（抑菌圈直徑-菌餅直徑）/菌餅直徑×100%。

1.6 牛津杯法復篩

直接垂直插上已滅菌的牛津杯，輕輕加壓（注意不能與培養(yǎng)皿底部接觸）[14]，使其與培養(yǎng)基接觸無空隙，每個平板插4個牛津杯，將初篩中有拮抗活性的菌株菌懸液100 ul加入到牛津杯中，置28 ℃培養(yǎng)48 h[15]，十字交叉法測量抑菌圈直徑大小，記錄數(shù)據(jù)。每種處理重復三次，以向牛津杯中加入100 ul的無菌水代替菌懸液做為對照（CK）。相對抑菌率（%）=（抑菌圈直徑-菌餅直徑）/菌餅直徑×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 生姜內(nèi)生細菌的分離純化

通過反復分離純化，并按照菌落、菌株形態(tài)、大小、顏色等特征進行區(qū)分，共獲得9株可培養(yǎng)的內(nèi)生細菌，依次編號為SJ1-SJ9。

2.2 拮抗菌株的初篩

對分離純化得到的9株生姜內(nèi)生菌菌株進行了皿內(nèi)對峙法拮抗試驗，9個菌株均具有不同程度的抑菌效果，其中有7個菌株對四種病原細菌的抑菌圈直徑均大于12.5mm，相對抑菌率均超過150%（如表1）。

2.3 拮抗功能菌株得復篩

對初篩得到的7個菌株進行牛津杯法復篩，結(jié)果表明7個菌株對四種病原細菌都有不同程度的抑菌效果，其中SJ1和SJ9的抑菌效果比較明顯，對四種病原細菌的抑菌圈直徑超過13 mm，相對抑菌率超過170%（表2）。

3 結(jié)論與討論

（1）因生姜內(nèi)生細菌大多數(shù)具有抑菌作用，其中SJA和SJI抑菌圈的直徑大于等于13.7 mm，具有較強的抑菌效果。在初篩過程中SJA對大腸桿菌、MRSA、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的抑菌圈大小依次為：13.8 mm、14.5 mm、13.7 mm、13.3 mm。在復篩過程中SJA對大腸桿菌、MRSA、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌抑菌圈的大小依次為：13.7 mm、13.7 mm、13.7 mm、13.8 mm。在初篩過程中SJI對大腸桿菌、MRSA、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌抑菌圈的大小依次為：13.1 mm、12.7 mm、13.4 mm、13.2 mm。在復篩過程中SJI對大腸桿菌、MRSA、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌抑菌圈的大小依次為13.7 mm、13.8 mm、13.8 mm、13.6 mm。

（2）本試驗中，判斷抑菌作用強弱的是抑菌圈的大小，此方法具有一定的局限性，通常只能定性判斷內(nèi)生細菌對靶標菌有無抑菌效果，不能確定內(nèi)生細菌抑菌的機制。

（3）生姜內(nèi)生細菌大多數(shù)具有很強的抑菌效果[16]，在醫(yī)學方面新藥的研發(fā)具有很高的研究價值，是一種重要的天然來源。

（4）本試驗只是對生姜莖的內(nèi)生細菌進行了分離和篩選，而葉等器官沒有進行內(nèi)生細菌的分離和篩選，還等進一步進行研究。

（5）本次試驗中，SJ1和SJ9初篩和復篩過程中抑菌圈大小存在差異，二者之間是否存在一定的聯(lián)系還不確定。

參考文獻

[1]劉杰鳳，周天，王穎，等.小白菜內(nèi)生菌的分離及菌核菌拮抗菌的篩選[J].湖北農(nóng)業(yè)科學，2007，13（50）：2676-2679.

[2]余波，趙力，曹建波，等.植物內(nèi)生菌活性物質(zhì)研究進展[J].安徽農(nóng)學通報，2008，14（3）：31-32.

[3]周濤，肖亞中，李妍妍，等.茜草內(nèi)生菌的分離鑒定及其抗菌活性物質(zhì)研究[J].生物學雜志，2007，2（24）：1-12.

[4]馬艷，趙江濤，常志州，等.西瓜內(nèi)生枯草芽孢桿菌BS211的拮抗活性及盆栽防效[J].江蘇農(nóng)業(yè)學報，2006，22（4）：388-399.

[5]戴傳超，余伯陽，趙玉婷，等.大戟內(nèi)生菌的抑菌活性及其與宿主相關性研究.應用生態(tài)學報，2005，7（16）：1290-1294.

[6]張淑梅，沙長青，王玉霞，等.大豆內(nèi)生細菌的分離及根腐病拮抗菌的篩選鑒定[J].微生物學通報，2008，35（10）：1593-1599.

[7]楊鳳珍，高兆銀，李敏，等.黃皮果實炭疽病病原菌鑒定及其拮抗內(nèi)生菌篩選[J].中國南方果樹，2008，6（37）：48-50.

[8]蘆云，羅明.哈密瓜內(nèi)生細菌的分離及拮抗菌的篩選[J].石河子大學學報：自然科學版，2005（22）：104-109.

[9]黎起秦，盧繼英，林緯，等.辣椒內(nèi)生菌拮抗細菌的篩選[J].廣西農(nóng)業(yè)生物科學，2004，4（23）：304-306.

[10]易有金，尹華群，羅寬，等.煙草內(nèi)生短短芽孢桿菌的分離鑒定及對煙草青枯病的防效[J].植物病理學報，2007，37（3）：301-306.

[11]曹榮花，劉曉光，高克祥，等.蘆葦內(nèi)生真菌Choiromyces aboriginum M1w1c6的拮抗作用及其生物防治潛力[J].植物保護學報，2008，2（35）：107-112.

[12]王剛，李志強.小麥內(nèi)生細菌的分離及其對小麥紋枯菌的拮抗作用[J].微生物學通報，2005，32（2）：20-24.

[13]李萌，張海濤，虞星炬，等.蔬菜內(nèi)生菌的分離及其生防功能初探[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學，2003（5）：60-64.

[14]劉曉光，高克祥，谷建才，等.毛白楊內(nèi)生菌優(yōu)勢種毛殼ND35室內(nèi)拮抗作用的研究[J].林業(yè)科學，1999，5（35）：57-61.

[15]袁紅旭，周錦蘭，鄭向華，等.內(nèi)生細菌生物效應分析[J].中國油料作物學報，2005，3（27）：62-65.

[16]孫霞，方濤，秦燕.生姜莖基腐病病原鑒定及生物學特性研究[J].天津農(nóng)業(yè)科學，2012，18（5）：29-31.