對蝦細胞永生性轉化研究進展

摘 要：對蝦細胞系是研究對蝦病毒和發(fā)展病毒疫苗的有利工具和技術。但由于體外培養(yǎng)對蝦細胞的有絲分裂相極低，難以脫分化，致使對蝦的永生性細胞系一直未能成功建立。本文從物理、化學和生物學方面綜述了對蝦細胞的永生性轉化研究概況，并展望了建立對蝦永生性細胞系的研究前景。

關鍵詞：對蝦細胞 永生性轉化 研究進展

中圖分類號：R73 文獻標識碼：A 文章編號：1672-3791（2013）04（c）-0248-02

隨著對蝦人工養(yǎng)殖集約化的發(fā)展，對蝦病毒病日益頻繁爆發(fā)，對蝦細胞系是分離和純化對蝦病毒、研究病毒的致病機理、發(fā)展有效的診斷試劑和防控技術以及生產高效的病毒疫苗等的有利工具和研究技術。為建立對蝦細胞系，國內外專家學者進行了大量的探索和不懈的努力，對蝦細胞難以脫分化和有絲分裂壽命短是對蝦細胞一直未能成功建系的兩個制約性問題。人們逐漸意識到，僅僅靠改進對蝦細胞培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件可能難以實現對蝦細胞的永生性轉化。因此隨著分子生物學的發(fā)展，逐漸有人開始嘗試采用物理、化學和生物學方法來誘導轉化對蝦的原代細胞，以期望獲得永生化的對蝦細胞系。

1 物理方法誘導對蝦原代培養(yǎng)細胞永生性轉化

X-射線、電離輻射和60Co射線處理可以誘導細胞遺傳物質發(fā)生變異，從而干擾細胞的衰老機制，激活細胞永生性相關基因的表達，是哺乳動物細胞常用的行之有效的永生性轉化物理誘導手段。1990年，Crane最早嘗試采用γ射線、x-射線和電離輻射處理原代培養(yǎng)的對蝦細胞以使之發(fā)生變異成為永生性的細胞系，但是沒有成功。雖然失敗了，但這是對蝦細胞永生性轉化道路上的一次很好的探索[1]。

2 化學方法誘導對蝦原代培養(yǎng)細胞永生性轉化

5-溴尿嘧啶（BU）、甲基磺酸乙酯（EMS）、和N-甲基-N′-亞硝基胍類化合物（MNNG）等化學誘變劑都可引起細胞癌變，發(fā)生永生性轉化。2001年，郎剛華等應用MNNG對中國明對蝦淋巴組織原代培養(yǎng)細胞進行多次化學誘變處理，雖然誘變后的細胞呈現多層生長，并出現由成纖維樣變?yōu)樯掀拥绒D化特征，但沒有實現連續(xù)傳代[2]。

3 生物學方法誘導對蝦原代培養(yǎng)細胞永生性轉化

3.1 生長因子

細胞生長因子具有刺激細胞生長和繁殖，抑制細胞分化的生物學特性。1995年，Hsu等首次采用堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）對斑節(jié)對蝦的淋巴細胞進行誘導轉化，發(fā)現經誘導處理后的淋巴細胞不需飼養(yǎng)層就可生長繁殖，并傳代超過90代[3]。但隨后該細胞系被證實為污染的單細胞真核生物（Thraustochytrids）。2002年，樊廷俊等在對蝦細胞培養(yǎng)基中同時添加了bFGF和胰島素樣生長因子Ⅱ（IGF-II）以誘導中國明對蝦淋巴細胞轉化，轉化后的細胞在報道時已傳代培養(yǎng)4代，但并未見到成功建系的后續(xù)報道。雖然已有不少研究發(fā)現在添加生長因子的情況下，對蝦細胞的生存和增殖能力獲得了不同程度的改善，但是目前還未發(fā)現哪一些生長因子能支持對蝦細胞發(fā)生自發(fā)性轉化并獲得無限增殖能力。

3.2 細胞融合

通過細胞融合有可能獲得具有兩種親本細胞生物學特性的雜交細胞。將已成系的永生性細胞與對蝦細胞融合，有可能獲得具有無限增殖能力的對蝦細胞。2001年，樊廷俊和史振平將已成系的牙鲆鰓細胞（FG）與中國對蝦淋巴組織原代培養(yǎng)細胞，通過聚乙二醇（PEG）誘導融合法進行雜交，篩選出可繼代培養(yǎng)的雜交細胞，并將雜交細胞傳代培養(yǎng)12次，但未見有該對蝦雜交細胞成系的后續(xù)報道[4]。2010年，Claydon等同樣采用PEG誘導融合法分別將鯉魚上皮瘤細胞系（EPC）和草地夜蛾蛹卵巢細胞系（Sf9）與對蝦血淋巴原代培養(yǎng)細胞進行融合，并成功篩選得到雜交細胞系，但是該細胞系缺乏甲殼綱動物細胞體外病毒復制的關鍵成分不能用于對蝦病毒的研究，因而不能解決對蝦細胞建系的根本目的。

3.3 病毒癌基因

猿猴病毒40（SV40）是簡單的真核細胞病毒，SV40的大T抗原（SV40LT）可抑制腫瘤抑制因子p53蛋白的活性，因而將SV40LT基因導入哺乳動物細胞中，可成功誘導細胞的永生性轉化[5]。1995年，Tapay等首次采用脂質體轉染法成功將SV40LT基因轉染到南美藍對蝦原代培養(yǎng)淋巴細胞中，發(fā)現轉染后淋巴細胞呈圓形，聚集成葡萄樣細胞團，貼壁不緊，生長速度加快，可傳代18～44次以上；而未轉染的淋巴原代細胞呈成纖維樣，貼壁緊，不能傳代。遺憾的是，最終也沒有成功建立對蝦淋巴細胞永生性的細胞系。2006年，胡國斌等利用復制缺陷型-泛嗜性逆轉錄病毒作為載體，也成功將SV40LT基因轉染到中國對蝦原代培養(yǎng)淋巴細胞中，轉基因細胞呈現了轉化特征，但傳代細胞由于真菌污染未能保留下來。

人乳頭狀多瘤病毒（human papilloma virus，HPV）的E6和E7基因編碼的E6和E7蛋白可分別與抑癌基因p53和Rb結合，從而影響細胞的增殖、轉移和細胞周期，誘發(fā)細胞永生性轉化。2008年，Claydon將HPV的E6和E7基因轉染到紅螯螯蝦的原代培養(yǎng)細胞中，結果發(fā)現轉染細胞可存活4個月，但存活的對蝦細胞不分裂[6]。

4 前景展望

成功建立對蝦連續(xù)性細胞系的關鍵問題之一是對蝦培養(yǎng)細胞的永生性轉化。哺乳動物細胞中端粒酶活性的有無決定了細胞壽命的長短。腫瘤細胞的端粒酶常常被激活而獲得永生性。Lang等（2004）報道，對蝦細胞中可檢測到端粒酶活性，而且日本對蝦淋巴組織原代培養(yǎng)細胞的端粒酶的活性可以維持30天[7]。但Jayesh（2012）在對蝦原代培養(yǎng)細胞中卻并未檢測到端粒酶活性。因此，通過轉染端粒酶基因是否能夠提高體外培養(yǎng)對蝦細胞的壽命，以獲得永生性對蝦細胞系尚有待進一步實驗驗證。

分子重編程技術是近年來發(fā)展起來的一種通過在細胞中過表達多能性因子來實現分化細胞向多能干細胞逆轉的技術。2006年，山中伸彌領導的研究小組利用逆轉錄病毒基因轉移技術，將4個多能性轉錄因子（Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc）共轉染到小鼠成纖維細胞中，成功誘導成纖維細胞的去分化，并重編程為多能干細（即iPS細胞），而且所獲得的iPS細胞有高達50%的動物致瘤性。因此，將分子重編程技術應用于對蝦細胞，以實現對蝦細胞的脫分化與永生性轉化，不失為今后對蝦細胞建系的一個新的研究方向和突破口。

對蝦永生性細胞系的建立是一個不斷探索的過程，可能需要漫長的時間。目前，盡管對蝦細胞永生性轉化未取得成功，但實驗中的嘗試和探索為最終實現體外培養(yǎng)對蝦細胞的永生性轉化奠定了基礎，并為以后的研究和發(fā)展提供了經驗和借鑒。

參考文獻

[1]Crane，M St J.Mutagensis and cell transformation in cell culture[J].Methods in Cell Science，1999，21：245-253.

[2]郎剛華，王勇，陳西廣，等.中國對蝦淋巴組織的長期原代培養(yǎng)和化學誘變初探[J].青島海洋大學學報，2001，31（3）：411-414.

[3]Hsu Y-L，et al.Development of an in vitro subculture system for the oka organ（Lymphoid tissue）of Penaeus monodon[J].Aquaculture，1995，136： 43-55.

[4]樊廷俊，史振平.牙鲆鰓細胞與中國對蝦淋巴細胞雜交細胞的體外培養(yǎng)[J]. 水產學報，2001，25（1）：11-15.

[5]Berthon P，Goubin G，Dutrillaux B，et al.Single-step transformation of human breast epithelial cells by SV40 large T oncogene[J].Int J Cancer， 1992，52（1）：92-97.

[6]Claydon K，Owens L.Attempts at immortalization of crustacean primary cell cultures using human cancer genes[J].In Vitro Cellular & Developmental Biology-Animal，2008，44（10）：451-457.

[7]Lang G H，et al. Detection of telomerase activity in tissues and primary cultured lymphoid cells of Penaeus japonicas [J].Mar.Biotechnol，2004（6）：347-354.