與口腔黏膜病相關的假絲酵母菌代謝組學鑒定的初步研究

李淼　張曉敏　司慶宗

[摘要] 目的 分析3種假絲酵母菌的磁共振代謝物圖譜，探討用代謝組學方法快速鑒定口腔黏膜致病菌的可行性。方法 在沙保培養(yǎng)基中分別接種白色假絲酵母菌ATCC 10231、熱帶假絲酵母菌ATCC 13803和光滑假絲酵母菌ATCC 15126，繪制生長曲線，選擇3種菌生長穩(wěn)定期的培養(yǎng)液檢測其磁共振圖譜，用主成分分析法進行數據分析。結果 主成分分析法顯示：每兩種細菌在主成分得分圖中有組間分散、組內聚集的特點，可以區(qū)分不同的假絲酵母菌。結論 代謝組學分析技術是一種有良好發(fā)展前景的口腔細菌快速鑒定技術。

[關鍵詞] 代謝組學； 磁共振； 假絲酵母菌； 主成分分析

[中圖分類號] R 739.86 [文獻標志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.03.018

白色假絲酵母菌、熱帶假絲酵母菌、光滑假絲酵母菌是正常人口腔、胃腸道、呼吸道及陰道黏膜的常見共生菌，僅能在特定條件下造成宿主感染。代謝組學是20世紀90年代中期發(fā)展起來的一門對生物體或細胞的所有低相對分子質量代謝產物進行定量和定性分析的新技術。高分辨率磁共振（nuclear ma-

gnetic resonance，NMR）可用于對細胞外微量代謝組分進行檢測，得到相應的代謝圖譜，使用先進的軟件分析方法可以正確地歸類處理這些圖譜。本研究對與口腔黏膜病相關的3種假絲酵母菌的代謝圖譜進行比較，用主成分分析法（principal components ana-lysis，PCA）進行分析，探討用該方法尋找特征性產物來鑒定假絲酵母菌的可行性。

1 材料和方法

1.1 實驗菌株及實驗儀器

白色假絲酵母菌ATCC 10231、熱帶假絲酵母菌

ATCC 13803、光滑假絲酵母菌ATCC 15126（上海川翔生物科技有限公司）；CH-2生物顯微鏡（Olympus公司，日本），分光光度計（上海尤尼卡公司），高

速低溫離心機（Jouan公司，法國），-80 ℃低溫冰箱（Heto Ultra公司，美國），磁共振儀（Bruker公司，德國）；重水（上海楚柏實驗室設備有限公司）；分析軟

件SIMCA-P 11.0（Umea公司，瑞典）。

1.2 生長曲線的繪制

將白色假絲酵母菌、熱帶假絲酵母菌、光滑假絲酵母菌解凍，增菌48 h，經顯微鏡形態(tài)學檢查及科瑪嘉顯色培養(yǎng)基鑒定為純培養(yǎng)后，分別將3種假絲酵母菌接種于沙保培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h，用分光光度計調整菌懸液吸光度值為1.00±0.05備用。在9支試管中分別加入沙保培養(yǎng)液4.5 mL，在每支試管中加入白色假絲酵母菌菌懸液50 μL，同法將熱帶假絲酵母菌及光滑假絲酵母菌菌懸液50 μL分別加入9支試管中，各試管在37 ℃、200 r·min-1搖床行增菌培養(yǎng)，在3、6、9、12、24、36、48、60、72 h各取1支，旋渦振蕩器混勻30 s，分光光度計測量菌懸液吸光度值，以純沙保培養(yǎng)液作陰性調零，測定3種假絲酵母菌的菌懸液密度。將實驗重復3次，取每個時間點的平均值，以時間（h）為橫坐標，以OD600值為縱坐標繪制生長曲線。

1.3 測試樣本的制備

分別取3種假絲酵母菌生長穩(wěn)定期（培養(yǎng)36 h）的培養(yǎng)液于4 ℃、10 000 r·min-1離心10 min，吸取上清液1 mL，加0.5 mL磷酸鹽緩沖液（2.4 g·L-1 KH2PO4，

8 g·L-1 Na2HPO4，7.2 g·L-1 NaCl），混勻后靜置10 min，以相同條件（4 ℃、10 000 r·min-1）離心10 min，吸取上清液用0.22 μm濾紙過濾，取1.35 mL濾液，加入重水0.15 mL，混勻后將樣品移入核磁管中（每管1.5 mL），置于-80 ℃低溫冰箱保存，NMR測定前解凍并保持在0 ℃左右。

1.4 1H-NMR圖譜的采集和處理

將核磁管放入磁共振儀中進行1H-NMR譜掃描，樣本的掃描溫度設置為295 K室溫。采用磁共振儀專用參數，包括采集點數32×1 024，累加次數128次，每個樣本掃描后均收集到131 072個數據點，波寬為7 788.162 11 Hz，每個樣本掃描2～3 min，將得到的15個原始的自由感應衰減信號（free induction decay，

FID）輸入MestReC軟件進行傅里葉轉換（Fourier tran-sition，FT），并進行相位調整和基線調整，獲得相位滿意、基線平整的1H-NMR圖譜。調用軟件的積分工具，除去水峰所在區(qū)間，并對1H-NMR譜進行分段積分，其中每個FID信號有200個積分值。將每個樣本的積分值導入Excel表中備用。

1.5 數據分析

用PCA進行數據分析。用SIMCA-P 11.0軟件對200個積分值進行化學計量上的處理，以主成分矢量為坐標軸作二維圖，即得分圖，從而對不同的菌懸液進行分析，找出類別間的差異所在。

2 結果

2.1 3種細菌的生長曲線

3種假絲酵母菌的生長曲線見圖1。由圖1可見，3種菌的生長規(guī)律相似，36～48 h生長繁殖達到高峰，處于穩(wěn)定期，48 h后處于衰亡期。選擇生長穩(wěn)定期（36 h）的代謝物測1H-NMR圖譜。

2.2 1H-NMR圖譜的測定結果

圖2為白色假絲酵母菌、熱帶假絲酵母菌和光滑假絲酵母菌的1H-NMR圖譜，3種菌的氫譜輪廓相似，其代謝物集中在化學位移值為3.5×10-6和1.0×10-6附近，每種菌代謝物集中出現區(qū)域的波譜形態(tài)與強度并不完全一樣，但通過單純的1H-NMR圖譜無法清楚準確地區(qū)分3種菌。

2.3 PCA結果

以不同假絲酵母菌代謝物主成分矢量為坐標軸做出的PCA得分圖見圖3～5，可見不同數據有組間離散、同類數據有組內聚集的特點。白色假絲酵母菌散點圖內部有較好的聚集，與熱帶假絲酵母菌的得分圖沒有混雜（圖3）。白色假絲酵母菌相對于光滑假絲酵母菌的散點圖團聚性更好，可以很好地與光滑假絲酵母菌區(qū)分開，且散點圖均位于95%的可信區(qū)間內（圖4）。熱帶假絲酵母菌與光滑假絲酵母菌各自

的團聚性很好，不同細菌沒有混雜（圖5）。

3 討論

近年來，隨著廣譜抗生素的濫用，腎上腺皮質激素、細胞毒性藥物和放射治療的廣泛應用，口腔假絲酵母菌性損害日益增多。Shen等[1]在研究中國老

年人根面齲細菌學時指出，白色假絲酵母菌檢出率高達63.33%。Gbris等[2]認為，白色假絲酵母菌是齲病的危險因素之一，其數量與齲有很強的相關性。由此可見，分離和快速鑒定假絲酵母菌有很重要的臨床意義。在假絲酵母菌性損害中，最常見的是白色假絲酵母菌，其毒力最強。近年來光滑假絲酵母菌檢出率也逐漸增高，且對氟康唑等抗真菌藥物并不敏感，需要在臨床中加以區(qū)分，以選擇不同的治療方案。本實驗采用代謝組學鑒定法對3種假絲酵母菌進行分析鑒定，結果發(fā)現：基于NMR的代謝組學及一系列化學計量學和多元統(tǒng)計學方法可以區(qū)分不同的假絲酵母菌。

近年來，代謝組學在疾病診斷，植物、微生物研究中均有大量的文獻出現。作為一門研究生物體內源性代謝物整體及其變化規(guī)律的學科，代謝組學實際上是分析化學、化學計量學和生命科學的交叉學科。它利用了分析化學的各種譜學技術，包括磁共振波譜、質譜、色譜、紅外和拉曼光譜等進行研究。本研究的方法是常用的磁共振波譜，通過磁共振波譜獲得海量、多維的數據后進行正確的分析是本研究的關鍵步驟。

PCA是最常用的分析方法，是將分散于一組變量上的信息集中于幾個綜合指標上，發(fā)揮了數據降維分析的作用，避免淹沒于大量數據中[3]。從PCA得分圖可觀察樣品的集聚或離散程度。樣品分布點越靠近，說明這些樣品中所含有的變量和/或分子的組成和濃度越接近；反之，樣品分布點越遠離，其差異越大；因此，得分圖也可以更形象地稱為樣品分布散點圖。本實驗中，3張散點圖中不同的細菌無交叉，同一細菌間有聚集趨勢。在光滑假絲酵母菌與熱帶假絲酵母菌的散點圖中，數據呈現出很好的團聚性。PCA也存在一些問題，由于實驗的操作因素或樣本本身的原因經常會有離群樣本點存在，這會嚴重影響聚類結果[4]和生物標志物的尋找結果。此

外，同一細菌的不同代謝物可能有較明顯的尺度差異，主成分的選擇會受到濃度較大組分的影響[5]，一

些濃度小的代謝組分的影響通常體現不出來，而這些小濃度組分往往有很重要的生物學意義。本實驗也發(fā)現，在同一張散點圖中，光滑假絲酵母菌相對于白色假絲酵母菌的散點圖更加分散。在后續(xù)的研

究中，筆者認為，應該摸索如何用尺度同一化的方法進行數據預處理來消除數據的尺度差異。

經典的微生物分類方法多根據微生物形態(tài)學以及對不同底物的代謝情況進行表型分類。隨著分子生物學的發(fā)展，基因型分類法得到了廣泛應用，但是，某些菌株按照表型與基因型兩種方法分類時會得出不同的結果。在這種情況下，代謝譜分析法逐漸成為一種快速、高通量、全面的表型分類方法[6]。該方法可通過檢測細胞外代謝物進行鑒別，與現有其他細菌鑒定方法相比較，基于NMR的代謝組學技術具有樣品處理簡單、用量少（只需10 mg）、測定快

速（只需5 min）、無侵入性、不破壞樣品的結構性質

等優(yōu)點，可作為常規(guī)細菌鑒定分類方法的有益補充。

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（本文編輯 吳愛華）