金菊解毒顆粒質(zhì)量考察

丁志軍，羅美蘭，廖銀根，甘慧群 （江西省皮膚病專科醫(yī)院藥劑科，江西 南昌330001）

金菊解毒顆粒（批準(zhǔn)文號：贛藥制字Z20110033）系江西省皮膚病專科醫(yī)院中醫(yī)科專家經(jīng)十幾年臨床總結(jié)的經(jīng)驗方（專利號：ZL200410033920X），由金銀花、菊花、連翹、黃柏、赤芍、大黃、黃芩、天花粉等8味中藥組成，具有清熱解毒，燥濕行瘀，消腫排膿之功效。臨床上主要用于風(fēng)熱濕毒蘊結(jié)肌膚所致痤瘡、脂溢性皮炎、濕疹、丹毒等皮膚病，療效確切。為確保制劑的質(zhì)量，筆者根據(jù)處方中所含藥物化學(xué)成分及劑型的特點，研究制定了連翹、黃柏、赤芍的薄層色譜鑒別及制劑中綠原酸、芍藥苷的含量測定方法，用于控制該藥品質(zhì)量?，F(xiàn)報道如下。

1 材料

1.1 儀器 Agilent－1100 高效液相色譜儀（美國）；CAMAG TLC SCANNER Ⅲ型 薄 層 掃 描 儀（瑞 士）；CAMAG TLC SAMPLER4型自動點樣儀（瑞士）；PBQ－Ⅱ型薄層自動鋪板器（重慶南岸實驗電器廠）；BP－211D Sartorius電子天平（德國）。

1.2 試藥 綠原酸對照品（批號110753－200413，供含量測定用）、芍藥苷對照品（批號110736－201035，供含量測定用）、連翹對照藥材（批號120908－200915）、黃柏對照藥材（批號121510－201105）、赤芍對照藥材（批號121092－201003）均購自中國食品藥品檢定研究院；金菊解毒顆粒（江西省皮膚病專科醫(yī)院，批號110801，110802，110803）；甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別

2.1.1 連翹的TLC鑒別

（1）供試品溶液的制備：取本品5 g，加稀乙醇20 mL，超聲處理20 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加乙醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。

（2）對照藥材溶液的制備：取連翹對照藥材0.5 g，按供試品溶液的制備方法制成對照藥材溶液。

（3）陰性對照溶液的制備：按處方及制法，制成缺連翹的陰性樣品，取相當(dāng)于樣品的量，按供試品溶液的制備方法制成陰性對照溶液。

照薄層色譜法（中國藥典2010 年版一部附錄ⅥB）試驗，吸取上述溶液各10μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，使成條帶狀，以氯仿－甲醇（7∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾。連翹的TLC見圖1。

圖1 金菊解毒顆粒中連翹的薄層色譜圖1～3.供試品；4.連翹藥材；5.陰性對照Fig 1 TLC of Forsythia in Jinju Jiedu granules1－3.test sample；4.Forsythia；5.negative control

2.1.2 黃柏的TLC鑒別

（1）供試品溶液的制備：取本品5 g，加甲醇20 mL，超聲處理20 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇2 mL使溶解，作為供試品溶液。

（2）對照藥材溶液的制備：取黃柏對照藥材0.1 g，按供試品溶液的制備方法制成對照藥材溶液。

（3）對照品溶液的制備：取鹽酸小檗堿對照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液。

（4）陰性對照溶液的制備：按處方及制法，制成缺黃柏的陰性樣品，取相當(dāng)于樣品的量，按供試品溶液的制備方法制成陰性對照溶液。

照薄層色譜法（中國藥典2010 年版一部附錄ⅥB）試驗，吸取上述溶液各2μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上使成條帶，以正丁醇－冰醋酸－水（7∶1∶2）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，陰性對照無干擾。黃柏的TLC見圖2。

2.1.3 赤芍的TLC鑒別

（1）供試品溶液的制備：取本品5 g，加水飽和正丁醇20 mL，超聲處理20 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇2 mL 使溶解，作為供試品溶液。

（2）對照藥材溶液的制備：取赤芍對照藥材1 g，按供試品溶液的制備方法制成對照藥材溶液。

（3）對照品溶液的制備：取芍藥苷對照品，加甲醇制成每1 mL含2 mg的溶液，作為對照品溶液。

（4）陰性對照溶液的制備：按處方及制法，制成缺赤芍的陰性樣品，取相當(dāng)于樣品的量，按供試品溶液的制備方法制成陰性對照溶液。

圖2 金菊解毒顆粒中黃柏的薄層色譜圖1～3.供試品；4.黃柏藥材；5.鹽酸小檗堿對照品；6.陰性對照Fig 2 TLC of Cortex Phellodendri in Jinju Jiedu granules1－3.test sample；4.Cortex Phellodendri；5.reference substance of Berberine hydrochloride；6.negative control

照薄層色譜法（中國藥典2010 年版一部附錄ⅥB）試驗，吸取上述溶液各5μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，使成條帶狀，以氯仿－醋酸乙酯－甲醇－甲酸（40∶5∶10∶0.2）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾。赤芍的TLC見圖3。

圖3 金菊解毒顆粒中赤芍的薄層色譜圖1～3.供試品；4.赤芍藥材；5.芍藥苷對照品；6.陰性對照Fig 3 TLC of Red Peony in Jinju Jiedu granules1－3.test sample；4.Red Peony；5.reference substance of Paeoniflorin；6.negative control

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Phenomenex C18柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動相：甲醇（A）－1%磷酸溶液（B）梯度洗脫，洗脫條件見表1；DAD檢測器，檢測波長327 nm（綠原酸），230 nm（芍藥苷）；流速：0.8 mL·min－1；柱溫：40 ℃；進樣量：5μL。

表1 流動相梯度洗脫Tab 1 The mobile phase gradient elution

2.2.2 溶液的制備

（1）對照品溶液的制備 取綠原酸對照品、芍藥苷對照品適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加甲醇溶解制成每1 mL分別含0.34、0.11 mg的對照品溶液，即得（10 ℃以下保存）。

（2）供試品溶液的制備 取本品顆粒研細，取約1.0g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇溶液50 mL，稱定，超聲處理30 min，放冷，再稱定，用50%甲醇溶液補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，即得。

（3）陰性對照液的制備 按處方工藝分別制備缺金銀花、菊花和赤芍的金菊解毒顆粒陰性樣品，按“2.2.3”項下方法制備陰性對照溶液。

2.2.3 專屬性試驗 按上述色譜條件，分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各5μL 注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果，供試品在與對照品色譜圖相應(yīng)的位置上有相同的綠原酸峰、芍藥苷峰，而陰性對照無干擾。色譜圖見圖4。

圖4 金菊解毒顆粒高效液相色譜圖A.綠原酸對照品；B.金菊解毒顆粒提取液；C.陰性（缺金銀花、菊花）；D.芍藥苷對照品；E.金菊解毒顆粒提取液；F.陰性（缺赤芍）1－綠原酸；2－芍藥苷Fig 4 HPLC chromatogram of Jinju jiedu granulesA.reference substance of chlorgenic acid；B.Jinju Jiedu granules extract；C.negative（lack chrysanthemun，Honeysuckle）；D.reference substance of paeoniflorin；E.Jinju Jiedu granules extract；F.negative（lack of Radix Paeoniae Rubra）1－chlorogenic acid；2－paeoniflorin

2.2.4 線性范圍的考察 精密吸取混合對照品溶液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0μL分別注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，進樣量（μg）為橫坐標(biāo)，進行線性回歸，綠原酸的回歸方程為：Y＝119 381.86 X＋0.47，線性范圍為0.68～3.40μg（r2＝0.999 8）；芍藥苷的回歸方程為：Y＝554 197.55 X＋0.34，線性范圍為0.22～1.10 μg（r2＝0.999 6）。

2.2.5 精密度試驗 取對照品溶液，注入液相色譜儀，連續(xù)進樣6次，每次5μL，測得綠原酸、芍藥苷平均峰面積值，RSD 分別為0.28%，0.17%，表明精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗 精密吸取對照品溶液，分別在0、2、4、6、8 h進樣，進樣量為5μL，測得綠原酸、芍藥苷吸收平均峰面積值，RSD 分別為0.37%（n＝5）和0.30%（n＝5），結(jié)果表明綠原酸、芍藥苷在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7 重復(fù)性試驗 取同一批樣品6 份，精密稱定，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進樣測定，進樣量為5μL，測得峰面積值，計算綠原酸、芍藥苷含量，RSD 分別為0.80%，0.49%，結(jié)果表明此法重復(fù)性良好。

2.2.8 回收率試驗 取同一批已知含量的樣品（批號110801）6份，分別精密加入一定量的綠原酸、芍藥苷對照品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進樣測定，進樣量為5μL。結(jié)果見表2。

2.2.9 樣品測定 取本品3批，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進樣測定，進樣量為5μL。結(jié)果見表3。

由試驗結(jié)果可知，儀器的精密度、指標(biāo)成分的穩(wěn)定性、方法的重復(fù)性和加樣回收率等均較好，符合定量要求。根據(jù)測定結(jié)果，暫定每1 g金菊解毒顆粒中含金銀花、菊花以綠原酸計，不得少于5.51 mg；含赤芍以芍藥苷計，不得少于3.68 mg（取3批平均含量的80%為其下限）。

表2 金菊解毒顆粒加樣回收率試驗結(jié)果（n＝6）Tab 2 Results of recovery test of Jinju Jiedu granules（n＝6）

表3 金菊解毒顆粒樣品含量測定結(jié)果（n＝3）Tab 3 Results of content determination of Jinju Jiedu granules（n＝3）

3 討論

金菊解毒顆粒處方中的藥味較多，成分復(fù)雜，薄層鑒別有較大困難。筆者對處方中每味藥材都進行了TLC 鑒別方法實驗條件摸索，經(jīng)過反復(fù)試驗，進行多因素實驗條件的比較，制定出本制劑中連翹、黃柏和赤芍的薄層鑒別方法。在赤芍的薄層鑒別中，曾參考文獻［1］，用乙醇處理樣品，展開后斑點分離不理想，后改用水飽和正丁醇提取，結(jié)果斑點顯色清晰，分離效果好。

金銀花作為金菊解毒顆粒中的君藥，其主要活性成分綠原酸含量較高，且為臣藥菊花所共有成分，故選其為制劑含量測定的指標(biāo)成分之一；臣藥赤芍投料量較大，因此選擇其所含主要有效成分芍藥苷作為含量測定的另一指標(biāo)。在指標(biāo)成分含量測定考察時，筆者曾參考文獻［2－3］色譜條件以HPLC法同時測定金菊解毒顆粒中綠原酸、芍藥苷含量，分離結(jié)果均不理想；改用甲醇－1%磷酸溶液梯度洗脫可將2個組分完全分離（分離度均大于1.5），且分析速度快，重現(xiàn)性好，供試品制備方法簡單，可作為該制劑定量的指標(biāo)。

綜上所述，所建方法可用于金菊解毒顆粒的質(zhì)量控制。

［1］ 中國藥典.一部［S］.2010：147.

［2］ 褚文靜，張雪，王偉，等.HPLC法測定抗感膠囊中綠原酸、咖啡酸、芍藥苷、木犀草苷和蘆丁［J］.中草藥，2010，41（1）：66－68.

［3］ 劉元媛，盧靜華，郭偉英，等.RP－HPLC法測定抗感顆粒中芍藥苷和綠原酸的含量［J］.中國藥房，2011，22（40）：3820－3821.