聽覺剝奪后大鼠聽皮層神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)變化和SHP－2基因的表達△

黃河銀 劉硯星 徐鷗 王玉杏 路虹

聽覺剝奪是指通過藥物致聾、噪聲致聾和雙側(cè)耳蝸毀損致聾等方法引起聽覺外周器官在結(jié)構(gòu)和／或功能上的退變，進而再逐級影響聽覺中樞的間接性退變。聽覺中樞結(jié)構(gòu)自下而上主要包括蝸神經(jīng)核、上橄欖核、外側(cè)丘系、下丘、內(nèi)側(cè)膝狀體和聽皮層。借助聽覺剝奪的實驗造模方法，相關(guān)的研究領(lǐng)域可延伸至神經(jīng)核團、神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)投射、基因調(diào)控和神經(jīng)元細胞凋亡蛋白酶等若干方向［1］，以期從這五個互不相同但卻彼此相關(guān)的方面明確聽中樞結(jié)構(gòu)和功能的可塑性變化。蛋白酪氨酸磷酸酶2 型（src－h(huán)omology domain containing protein tygosine phosphatase type 2，SHP－2）基因在細胞核中的激活機制對神經(jīng)系統(tǒng)有著重要影響，其中間產(chǎn)物參與了多條信號通路的調(diào)節(jié)，分別對細胞的生長和分化施以正向調(diào)控［2］。本研究擬通過觀察雙側(cè)耳蝸毀損后2個月內(nèi)大鼠聽皮層神經(jīng)元細胞的形態(tài)學(xué)變化及SHP－2基因的表達變化，探討SHP－2對聽皮層神經(jīng)元細胞凋亡的調(diào)控作用和聽覺中樞的可塑性機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組及處理 選擇生后2周的SPF級雄性SD 大鼠48只，檢測雙耳ABR 反應(yīng)閾均在15dB SPL以內(nèi)，然后將其隨機分為4個實驗組（2周組、4周組、6周組、8周組）和4個相應(yīng)對照組，每組6只。實驗組動物行雙側(cè)耳蝸損毀術(shù)，對照組只予麻醉和耳后切口，不做耳蝸毀損。術(shù)后對實驗組動物再行ABR 檢測，以雙耳反應(yīng)閾均在90dB SPL以上為造模成功。在相同條件下飼養(yǎng)各組至對應(yīng)的時間點后，提取實驗動物的雙側(cè)大腦聽皮層，制作免疫組織化學(xué)切片，觀察形態(tài)學(xué)變化，并用RT－PCR技術(shù)檢測SHP－2的表達情況。本研究經(jīng)醫(yī)院動物倫理委員會批準通過。

1.2 雙側(cè)耳蝸損毀術(shù)［3］按8 ml／kg 給予動物5%水合氯醛溶液麻醉，然后在雙側(cè)耳后約1cm×1 cm 的區(qū)域沿耳后溝作長約1.5cm 的弧形切口，分離皮下筋膜，向后牽拉胸鎖乳突肌上份，暴露面神經(jīng)，沿面神經(jīng)走行向上分離至莖乳孔處，暴露聽泡，剝離聽泡表面的筋膜，然后用探針在聽泡表面前中1／3處鉆孔，進入鼓室，暴露鼓岬。用探針在鼓岬隆起處鉆孔，見透明的淋巴液溢出，改用鉤針從鉆孔處小心伸入并適度旋轉(zhuǎn)，絞毀蝸軸和骨螺旋板，用一小塊明膠海綿放于術(shù)腔鼓室內(nèi)，貫穿縫合切口，將大鼠置于安靜而黑暗的環(huán)境中保溫復(fù)蘇，術(shù)后1周拆線。

1.3 ABR 檢測 于術(shù)前及各組大鼠術(shù)后第2天行ABR 檢測，用水合氯醛溶液行腹腔注射麻醉，在鼻尖、鼻背、額頂、雙側(cè)耳廓背面?zhèn)淦?。ABR 檢測（北京麥德林醫(yī)療器械公司，型號ZCS－CAARTREP）在隔聲屏蔽室內(nèi)進行，記錄電極置于大鼠額頂正中，參考電極置于耳廓背面，接地電極置于鼻尖鼻背處。將耳機妥善固定于離外耳道口1cm 處，用濾波短聲刺激，極性交替，刻度0.5μV，速率21.1s，增益50k，脈沖寬0.1 ms，掃描時間10 ms，疊加1 000次，步距5dB，以波Ⅲ剛出現(xiàn)的最穩(wěn)定的刺激聲強度為反應(yīng)閾［4］。

1.4 聽皮層取材 動物飼養(yǎng)至規(guī)定時間后，實驗組和對照組同時取材。用水合氯醛溶液行腹腔注射麻醉，在肋緣平面作橫切口，分離皮下組織。沿前正中線剪開胸腔，暴露心包。左心室快速灌注生理鹽水5min，然后繼續(xù)灌注4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液10 min。項部銳性斷頭，從枕骨大孔沿顱骨矢狀縫向前剪開顱骨，翻剝兩側(cè)頂骨，直至完整取出雙側(cè)大腦半球，制作蠟塊。蠟塊包埋前，參照《大鼠腦立體定位圖譜》［5］，保守確定聽皮層所在區(qū)域，于前囟后方3.14mm（即對耳線前方5.86mm）處沿冠狀面垂直下刀，確定為聽皮層區(qū)域的前界，再于前囟后方6.30mm（即對耳線前方2.70mm）處沿冠狀面垂直下刀，確定為聽皮層區(qū)域的后界。梯度酒精脫水和二甲苯溶液透明后，以冠狀面作為切面向下將標本包埋，然后室溫下自然冷卻2h，即可將冠狀面作為切面行連續(xù)切片，切片厚度為5μm。

1.5 HE染色和Nissl染色 HE 染色用二甲苯脫蠟2次，無水乙醇洗去二甲苯2次，依次浸入95%、80%、70%酒精水化，蘇木精染色。然后1%鹽酸酒精分化，1%氨水返藍，伊紅染色，再依次浸入70%、80%酒精脫水，最后95%酒精脫水，無水乙醇脫水，二甲苯透明，直至輕柔甩干，中性樹脂封片。Nissl染色用二甲苯脫蠟2次，無水乙醇涮洗3次；然后依次浸入95%、80%、70%酒精水化，再浸入1%焦油紫水溶液，放入37℃恒溫箱中染色，最后取出，依次浸入70%、80%酒精脫水，90%酒精分化脫色，鏡下可見Nissl小體顯示清晰且背景無色后，用無水酒精快速脫水，直至二甲苯透明和最后封片。Nissl染色最主要的目的是見證正常聽皮層神經(jīng)元細胞中胞漿里面嗜堿性的藍色顆粒或網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，即Nissl小體。光鏡下觀察聽皮層神經(jīng)元的形態(tài)、大小、分布以及胞漿、胞核、核仁的對比變化。

1.6 RT－PCR 取材和檢測 切取新鮮的聽皮層灰質(zhì)組織，用Trizol試劑提取聽皮層神經(jīng)元細胞總RNA，在各實驗組取同等量的RNA 行反轉(zhuǎn)錄和PCR。設(shè)計目的基因的上游引物為5’－AGAGTCCCC TGCCACCTTGC－3’，下游引物為5’－CTCATCTGAAACTCCTCTGCTGCTG－3’，擴增產(chǎn)物大小為114bp。擴增程序為95 ℃變性10 min，95℃10s，55℃30s，72℃40s，循環(huán)40次。結(jié)果用ABI 7500型熒光定量PCR 儀，以2－△△CT法進行數(shù)據(jù)的相對定量分析，目的基因mRNA 的相對表達量以同一反應(yīng)體系中實驗組的熒光定量指數(shù)與對照組的比值來表示。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析，實驗組和對照組的ABR 反應(yīng)閾比較用配對t檢驗，RT－PCR 的結(jié)果用隨機區(qū)組方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠術(shù)后一般狀況和ABR 檢測結(jié)果 術(shù)后第2天，大鼠即能自由活動，無斜頸和口角偏斜，行動能保持平衡，但與對照組相比，實驗組動物反應(yīng)遲緩，耳廓反射消失。各組大鼠在飼養(yǎng)過程中均無切口紅腫等感染跡象。實驗各組聽覺剝奪造模手術(shù)后ABR 反應(yīng)閾均顯著升高，與造模前及對照組比較差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）（表1）。

表1 各實驗組聽覺剝奪造模前后及對照組ABR反應(yīng)閾（dB SPL，±s）

表1 各實驗組聽覺剝奪造模前后及對照組ABR反應(yīng)閾（dB SPL，±s）

注：＊ 與實驗組造模前及對照組同期比較，P＜0.01

2w4w6w8w實驗組造模前組別13.3±2.47 12.5±2.61 12.9±2.57 13.3±2.46實驗組造模后95.8±1.03＊ 95.4±1.98＊ 95.1±1.83＊ 96.5±0.90＊對照組12.9±2.57 12.9±2.57 12.5±2.61 13.7±2.26

2.2 各組大鼠聽皮層神經(jīng)元細胞形態(tài)比較 HE染色可見，對照組正常的聽皮層細胞呈飽滿圓形，染色淺，分布均勻，胞漿和胞核清晰可見；與對照組相比，各實驗組都有不同程度的神經(jīng)元細胞體積萎縮，顏色深染，胞漿胞核窺視不清，細胞有不同程度的異形，或呈三角形，或呈菱形，以6周組和8周組為甚，說明雙側(cè)耳蝸損毀后大鼠聽皮層神經(jīng)元細胞發(fā)生了凋亡，且凋亡情況隨時間延長而加重（圖1）。Nissl染色可見類似的情況，正常的聽皮層細胞呈飽滿圓形，染色淺，分布均勻，胞漿和胞核清晰可見，可見Nissl小體；與對照組相比，實驗各組出現(xiàn)數(shù)量不等的異形細胞，體積有不同程度的萎縮，顏色深染，胞漿胞核窺視不清，Nissl小體消失（圖2）。

2.3 各組大鼠聽皮層神經(jīng)元SHP－2基因的表達 SHP－2基因的相對表達量（相對于對照組）在2周組為1.1±0.28，4周組為1.5±0.04，6 周組為2.5±0.08，8周組為11.0±0.06，隨時間延長，相對表達量逐漸升高，各組之間的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

圖1 聽覺剝奪后各組聽皮層神經(jīng)元細胞的HE染色（HE×400） a～e分別為2周組、4周組、6周組、8周組及對照組

圖2 聽覺剝奪后各組聽皮層神經(jīng)元細胞的Nissl染色（Nissl染色×400） a～e分別為2周組、4周組、6周組、8周組及對照組

聽覺剝奪后，聽中樞神經(jīng)元細胞凋亡趨勢會與日俱增并且不可逆轉(zhuǎn)，外周聽器的細胞數(shù)量急劇減少，傳入神經(jīng)系統(tǒng)會以減少傳入信號的方式將損害信息傳遞給聽覺中樞，后者為了使外周聽器適應(yīng)損傷后的病理狀態(tài)，會導(dǎo)致自身和外周都發(fā)生結(jié)構(gòu)和功能的可塑性變化，拓寬外毛細胞的調(diào)諧曲線，提高神經(jīng)纖維的興奮閾值，以代償聽覺中樞的損傷［6］。而聽覺剝奪后，聽皮層在保證聽中樞功能隨著內(nèi)外環(huán)境的變化做出相應(yīng)調(diào)整的同時，還能以功能重組和信息整合的方式表現(xiàn)出一定程度上的代償效用［7］。

SHP－2基因是蛋白酪氨酸磷酸酶基因家族中的一員，廣泛表達于各種組織的細胞，其N 末端含有2個2型同源性（SH2）結(jié)構(gòu)域，C 末端含有1個蛋白酪氨酸磷酸酶（PTP）結(jié)構(gòu)域和2 個酪氨酸殘基。這些特殊的結(jié)構(gòu)決定了SHP－2基因雖然在細胞核中的激活顯得較為獨立，卻對神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育有著重要影響。在正常狀態(tài)下，SHP－2 基因的催化活性因SH2結(jié)構(gòu)域和PTP結(jié)構(gòu)域的彼此結(jié)合而受抑制，但當含有磷酸化酪氨酸殘基的配體與SH2結(jié)構(gòu)域發(fā)生特異性偶聯(lián)后，PTP結(jié)構(gòu)域便會暴露催化位點，解除自身抑制，發(fā)揮酪氨酸磷酸酶活性和接頭蛋白的功能，參與Ras－ERK 和P13k－Akt等多條信號通路的調(diào)節(jié)［8］，對細胞的生長和分化施以正向調(diào)控。本實驗中，聽覺剝奪后大鼠聽中樞SHP－2基因的表達呈上升趨勢，且隨時間延長逐漸增高就是因為聽覺剝奪使大鼠發(fā)生了聽皮層神經(jīng)元細胞的失活，使聽皮層的細胞活動處于抑制狀態(tài)，從而激活了γ－氨基丁酸和突觸后抑制作用［9］，解除了SHP－2基因的抑制態(tài)，導(dǎo)致其表達隨著時間的推移而逐漸增加。

Hensch［10］認為雖然大腦皮層的發(fā)生和發(fā)育可能維系一生，但早期的經(jīng)歷具有更持久的影響和更重要的作用，這也是本實驗之所以選擇2周齡大鼠來觀察神經(jīng)元細胞形態(tài)學(xué)變化的原因。李孟等［11］研究了1個月之內(nèi)的大鼠同法造模后聽皮層突觸素的表達情況，發(fā)現(xiàn)在術(shù)后突觸素會因為出芽而短暫增高，第3天最高，然后會因為軸突末梢找不到靶器官逐漸下降，最低至第2周，說明在術(shù)后2周以前突觸素的活性表達相對較高，“去抑制－鄰取代－突觸軸”的進行相對較快，由此產(chǎn)生了相對較強的聽覺中樞可塑性。從文中結(jié)果看，實驗組大鼠聽皮層灰質(zhì)在術(shù)后第2周時，無論是在細胞形態(tài)、染色深淺和數(shù)量分布上都表現(xiàn)出相對較弱的凋亡狀態(tài)，與正常對照組相差不大，與上述結(jié)果相符。另外，張萌等［3］借助99Tcm－Annexin V 活體細胞凋亡顯像儀研究了大鼠蝸核神經(jīng)元在第4個月時的凋亡情況，發(fā)現(xiàn)實驗組的HE染色神經(jīng)元細胞計數(shù)明顯減少并且表現(xiàn)出凋亡的特征性改變，從而證明了在術(shù)后較長時間內(nèi)細胞凋亡持續(xù)存在，與本實驗中8周組的發(fā)展趨勢相符。

總之，本研究提示，聽覺剝奪可導(dǎo)致聽皮層神經(jīng)元細胞凋亡，凋亡的程度隨時間延長逐漸加重；SHP－2基因可促進聽皮層神經(jīng)元細胞的增生，增生的程度也隨時間延長而加重；在這兩個相互拮抗的因素中，凋亡是最終的結(jié)果。

1 Franklin SR，Brunso－Bechtold JK，Henkel CK.Bilateral cochlear ablation in postnatal rat disrupts development of banded pattern of projections from the dorsal nucleus of the lateral lemniscus to the inferior colliculus［J］.Neuroscience，2008，154：346.

2 張薇，楊金蓮，胡中倩，等.SHP－2酪氨酸磷酸酶激活突變導(dǎo)致小鼠髓系異常增殖［J］.中國病理生理雜志，2011，27：682.

3 張萌，陳曉巍，田永勝.耳蝸損毀后小鼠聽覺中樞的退行性改變［J］.中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2009，7：571.

4 Firat Y，Kizilay A，Ozturan O，et al.Experimental otoacoustic emission and auditory brainstem response changes by stellate ganglion blockage in rat［J］.Am J Otolaryngol，2008，29：339.

5 Paxinos G，Watson C，諸葛啟釧，主譯.大鼠腦立體定位圖譜［M］.第3版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2005.圖30～圖43.

6 Caspary DM，Ling L，Turner JG，et al.Inhibitory neurotransmission，plasticity and aging in the mammalian central auditory system［J］.J Exp Biol，2008，211：1 781.

7 Chance SA，Casanova MF，Switala AE，et al.Auditory cortex asymmetry，altered mini column spacing and absence of aging effects in schizophrenia［J］.Brain，2008，131：3 178.

8 Seta K，Nanamori M，Modrall JG，et al.AT1receptor mutant lacking heterotrimeric G protein coupling activates the Src－Ras－ERK pathway without nuclear translocation of ERKs［J］.J Biol Chem，2002，277：9 268.

9 Boedtkjer E，Aalkjaer C.Insulin inhibits Na＋／H＋exchange in vascular smooth muscle and endothelial cells in situ：involvement of H2O2and tyrosine phosphatase SHP－2［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2009，296：H247.

10 Hensch TK.Critical period regulation［J］.Annu Rev Neurosci，2004，27：549.

11 李孟，華清泉，廖華，等.雙側(cè)耳蝸損毀后大鼠聽皮層突觸素表達的變化［J］.聽力學(xué)及言語疾病雜志，2008，16：495.