DIAPH3基因與聽神經(jīng)病譜系障礙＊

張嬌 綜述 王秋菊 審校

聽神經(jīng)病譜系障礙（auditory neuropathy spectrum disorder，ANSD），也稱為聽神經(jīng)?。╝uditory neuropathy，AN），是一種外毛細胞功能正常，而內(nèi)毛細胞和聽神經(jīng)突觸和／或聽神經(jīng)本身功能不良導(dǎo)致的聽功能障礙［1，2］。ANSD 典型的臨床表現(xiàn)［3～7］是言語理解力受損，而言語覺察閾和純音聽閾可以正常，也可以嚴重受損。ANSD 主要影響對快速變化聲信號的處理，即聽覺時間處理的能力［3］。

ANSD 的病因可為非遺傳因素和遺傳因素。非遺傳性因素［8～10］包括高膽紅素血癥、缺氧、營養(yǎng)代謝性疾病、自身免疫性疾病、感染性疾病、中毒性代謝性疾病等。近年來，隨著分子遺傳學(xué)研究的不斷深入，遺傳因素在ANSD 發(fā)病中的作用日益受到重視。在引起聽神經(jīng)病譜系障礙的眾多因素中，遺傳因素約占40%［11］，其遺傳方式涉及4種主要遺傳途徑，即常染色體顯性遺傳、常染色體隱性遺傳、X－染色體連鎖遺傳、線粒體遺傳。根據(jù)是否合并其他系統(tǒng)的疾病，ANSD 又可分為非綜合征型和綜合征型。很多ANSD 患者表現(xiàn)為非綜合征型遺傳，其中與常染色體顯性遺傳性相關(guān)的基因是DIAPH3（diaphanous homolog 3）基因［12，13］，與常染色體隱性遺傳相關(guān)的基因有 OTOF［14］、PJVK［15］和GJB2［16］，表現(xiàn)為X－染色體連鎖遺傳的基因座有AUNX1［17］，與線粒體遺傳相關(guān)的基因突變有12SrRNA T1095C突變［18］。其中，DIAPH3基因是第一個發(fā)現(xiàn)的與常染色體顯性遺傳性ANSD 相關(guān)的致病基因［11］，本文對該基因的結(jié)構(gòu)、功能及其與ANSD 的關(guān)系等綜述如下。

1 DIAPH3基因的結(jié)構(gòu)

DIAPH3基因又名AUNA1基因、DRF3基因，定位于13q21.2，DNA 序列全長498 403bp，含29個外顯子。由于剪接位點的不同，DIAPH3 基因有多種不同的轉(zhuǎn)錄變異體（表1），包括isoform a、isoform b、isoform c、isoform d、isoform e、isoform f、isoform g。有研究報道不同的轉(zhuǎn)錄本具有組織和時間特異性［19］，其中，isoform a 最長，常作為DIAPH3基因cDNA 的標準序列［20］，其mRNA 全長4 812bp，CDS 在mRNA 的220bp～3 801bp 區(qū)域，編碼含有1 193個氨基酸的蛋白質(zhì)。

表1 DIAPH3基因的不同轉(zhuǎn)錄本及其編碼的蛋白質(zhì)

DIAPH3基因編碼的蛋白質(zhì)diaphanous homolog 3（DIAPH3蛋白），是一種多結(jié)構(gòu)域的蛋白（圖1），包含一個氨基端的GTPase結(jié)合結(jié)構(gòu)域（GTPase binding domain，GBD）長度為183個氨基酸殘基（115～297）；一個FH3結(jié)構(gòu)域（formin homology 3，F(xiàn)H3），長度為193個氨基酸殘基（302～494）；一個FH2結(jié)構(gòu)域（formin homology 2，F(xiàn)H2），長度為374個氨基酸殘基（636～1 009）；一個C 端diaphanous自調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域（diaphanous antoregulatory domain，DAD），長度為15 個氨基酸殘基（1 060～1 074）［20～22］。DIAPH3蛋白屬于diaphanous相關(guān)成蛋白家族（diaphanous－related formins），目前已發(fā)現(xiàn)了該家族的3 個亞型（DIAPH1、DIAPH2、DIAPH3），DIAPH 3 與DIAPH1（5q31.3）有51.3%的同源性，與DIAPH2（Xq22）有57.3%的同源性。其中，DIAPH1基因與常染色體顯性遺傳性非綜合征型感音神經(jīng)性聾相關(guān)，DIAPH2與X－連鎖的卵巢功能早衰相關(guān)。人類DIAPH3 基因和蛋白與黑猩猩、獼猴、狗、牛、小鼠、大鼠及雞的同源核酸及蛋白質(zhì)序列在進化分析上高度保守［20］。

Schoen等［12］應(yīng)用RT－PCR 和Northern blot技術(shù)發(fā)現(xiàn)DIAPH3 基因是廣泛表達的。目前尚無DIAPH3 基因在內(nèi)耳的精確表達模式和具體表達部位的報道。

2 DIAPH3基因的功能研究

天然狀態(tài)下DIAPH3蛋白通過細胞內(nèi)FH3的DID（diaphanous inhibitory domain）結(jié)構(gòu)域（即di－aphanous抑制區(qū)）和羧基端的DAD 區(qū)域間相互作用而使得其活性處于自抑制狀態(tài)［23，24］。當活化的Rho GTPase結(jié)合GBD 后，這種自抑制狀態(tài)被解除，暴露出FH2和DAD的功能區(qū)，使之活化而促進肌動蛋白的聚集成核、延伸、加帽及微絲的繼續(xù)伸長等（圖1），最終對細胞粘附、細胞運動、細胞形態(tài)發(fā)生、細胞內(nèi)運輸、囊泡運輸?shù)绕鹬匾恼{(diào)控作用［25～27］。此外，有研究發(fā)現(xiàn)GBD結(jié)構(gòu)域決定DIAPH3蛋白的亞細胞定位，并影響囊泡和絲狀偽足的的活動［19］。

圖1 DIAPH3蛋白的結(jié)構(gòu)域組成和分子內(nèi)調(diào)節(jié)

Pawson等［28］在大規(guī)模篩查維持果蠅神經(jīng)肌肉接頭生長和／或穩(wěn)定所必須的基因時，發(fā)現(xiàn)diaphanous是突觸生長的重要調(diào)控因子；對果蠅行免疫組織熒光分析發(fā)現(xiàn)，diaphanous蛋白既存在于神經(jīng)肌肉接頭處的突觸前成分，也存在于其突觸后成分，同時發(fā)現(xiàn)diaphanous 蛋白作用于受體酪氨酸激酶Dlar的下游，通過調(diào)控神經(jīng)肌肉接頭處突觸前膜的肌動蛋白和微管細胞骨架，最終影響神經(jīng)肌肉接頭處的突觸的生長。

3 DIAPH3基因與ANSD

2004年Kim 等［29］報道了一個歐洲的常染色體顯性遺傳性ANSD 大家系，共研究了4代47人，均排除了顱神經(jīng)和周圍神經(jīng)病變，均為非綜合征型ANSD，其中2人經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)為純合突變，且與其余雜合突變的患者相比，除發(fā)病年齡較小外，臨床表現(xiàn)無明顯差異。Kim 等應(yīng)用單體型分析發(fā)現(xiàn)18歲以上的患者外顯率均為100%。該家系平均發(fā)病年齡為18.6歲。發(fā)病年齡最小的患者外毛細胞功能正常（可引出正常的OAE），而聽力有損失（根據(jù)純音測聽和／或ABR 結(jié)果），后隨著時間的推移，OAE消失，且聽閾提高，最后發(fā)展為極重度感音神經(jīng)性聾。Kim 等通過連鎖分析將該家系精確定位在13q14～21上的D13S153和D13S1317之間5.47厘摩的范圍，并將該位點命名為AUNA1，該家系命名為AUNA1家系［29］。

2010年，Starr等［30］進一步研究了AUNA1家系的臨床聽力學(xué)表型（表2），發(fā)現(xiàn)該家系的發(fā)病年齡為7～45歲，而在隨后的20年內(nèi)逐漸進展為極重度感音神經(jīng)性聾。該家系典型的癥狀為言語識別率明顯降低，有88%的患者反映言語理解能力下降，72%的患者反映在噪聲環(huán)境下言語理解能力進一步下降，72%的患者電話溝通有困難；38%的患者自覺助聽設(shè)備“有效”，可放大聲音，但不能提高言語識別率。該家系中3名患者行人工耳蝸植入術(shù)后，聽功能顯著提高，主要表現(xiàn)為電誘發(fā)聽性腦干反應(yīng)（EABRs）、聽覺時間處理能力和言語識別率明顯改善。據(jù)此Starr等提出，該家系患者的病變部位主要在聽神經(jīng)遠端，包括螺旋神經(jīng)節(jié)的樹突棘末端、內(nèi)毛細胞及二者之間的突觸，而螺旋神經(jīng)節(jié)細胞及其軸突功能完好，屬于遠端ANSD，即II型ANSD。此外，因該家系聽力損失的類型從年輕時的ANSD轉(zhuǎn)為老年時的感音神經(jīng)性聾，提示該家系的ANSD和感音神經(jīng)性聾可能是同一疾病不同時期的病理過程。

表2 AUNA1家系的臨床聽力學(xué)特點

Schoen 等［12］研究AUNA1 家系時，對家系中一個親緣關(guān)系較遠的患者DNA 樣本行基因型分型，將AUNA1 基因座進一步縮窄到長度約為11Mb、3.28cM 的區(qū)域，其中包含PCDH17 、PCDH20、TDRD3和DIAPH3共4個基因。PCDH17、PCDH20、TDRD3 的測序分析未發(fā)現(xiàn)任何突變，DIAPH3基因的測序分析發(fā)現(xiàn)其5＇UTR 區(qū)高度保守的GC框有c.－172G＞A 的突變，且與ANSD 表型共分離。隨后應(yīng)用微陣列基因表達技術(shù)，Schoen等發(fā)現(xiàn)受累患者淋巴母細胞系的DIAPH3基因的mRNA 較正常對照組過表達2～3倍。其中，雜合突變患者有2.11 倍的過表達，而純合突變患者有2.98倍的過表達；應(yīng)用定量免疫印跡技術(shù)發(fā)現(xiàn)受累患者的淋巴母細胞系的DIAPH3蛋白較正常對照組有1.5倍的過表達，其中，雜合突變患者有1.48倍的過表達，而純合突變患者有1.62 倍的過表達［12］。Schoen等進一步將可能的啟動子和5，UTR區(qū)（突變型、野生型）克隆到一個熒光素酶報告載體上，觀察c.－172G＞A 突變對DIAPH3 基因表達的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5，UTR 區(qū)c.－172G＞A 突變明顯上調(diào)了DIAPH3基因的表達，相對于野生型有約2～3倍的過表達，證實DIAPH3基因的5＇UTR 區(qū)對于轉(zhuǎn)錄調(diào)控有重要作用［12］。通過比較純合突變患者和正常對照組DIAPH3基因cDNA 的PCR 產(chǎn)物，Schoen等發(fā)現(xiàn)兩組的DIAPH3轉(zhuǎn)錄本無論是數(shù)量還是種類都無統(tǒng)計學(xué)差異，排除了DIAPH3基因的過表達是由不同轉(zhuǎn)錄本引起的這一猜想。為進一步研究diaphanous蛋白對聽覺系統(tǒng)的影響，Schoen建立了黑腹果蠅動物模型，其聽覺器官（Johnston’s organ，JO）可表達持續(xù)激活的diaphanous蛋白。實驗發(fā)現(xiàn)除少數(shù)果蠅死亡外，存活的果蠅聲誘發(fā)電位SEPs均顯著降低，約為0.25～0.75mV，而野生型果蠅的聲誘發(fā)電位為0.5～1.3mV，說明DIAPH3基因突變可影響聽覺器官的功能［12］。

通過上述一系列試驗，Schoen等證實DIAPH3基因是首個與非綜合征型顯性遺傳性ANSD 相關(guān)的基因［12］，其可能的致聾機制如下：DIAPH3基因的過表達影響螺旋神經(jīng)節(jié)樹突棘的功能［31］，由于聽神經(jīng)傳入纖維螺旋神經(jīng)節(jié)樹突95%支配內(nèi)毛細胞，5%分布于外毛細胞［32］，當螺旋神經(jīng)節(jié)樹突棘存在缺陷時，起初內(nèi)毛細胞受的影響更大，故病變早期，主要表現(xiàn)為中度聽力損失，ABR 缺失或者明顯異常，而DPOAE 和／或CMs存在。有文獻報道diaphanous蛋白參與調(diào)控神經(jīng)肌肉接頭處突觸前成分的肌動蛋白和微管細胞骨架［30］，從而調(diào)節(jié)毛細胞的形態(tài)和靜纖毛的長度［33，34］。DIAPH3 基因過表達最終影響到內(nèi)、外毛細胞的功能，表現(xiàn)為極重度聽力損失，ABR、DPOAE、CMs均引不出。因此，DIAPH3基因突變引起的ANSD 早期影響突觸后成分（螺旋神經(jīng)節(jié)樹突棘），晚期逐漸累及突觸前成分（內(nèi)、外毛細胞）［35］。

4 DIAPH3基因的篩查情況

Schoen等對AUNA1 家系4 代47 人行DIAPH3基因測序分析，發(fā)現(xiàn)DIAPH3基因5＇UTR 區(qū)高度保守的GC框有c.－172G＞A 的突變，并經(jīng)一系列試驗證明其為 AUNA1 家系的致病突變［12，23，24］。盧新紅等［36］對一個現(xiàn)存3代9人的常染色體顯性遺傳性ANSD 核心家系所有成員行DIAPH3基因5＇UTR區(qū)測序分析，并對其中1例患者行DIAPH3基因全部編碼區(qū)篩查，結(jié)果無陽性發(fā)現(xiàn)。

自2004 年首次鑒定AUNA1 基因座，并于2008年發(fā)現(xiàn)AUNA1家系的致病基因（DIAPH3 基因）至今，僅在AUNA1家系中發(fā)現(xiàn)該基因的1種致病突變，即5＇UTR 區(qū)的c.－172G＞A 突變。目前，尚未在中國ANSD 患者及其他耳聾患者中發(fā)現(xiàn)該基因的突變。

5 展望

DIAPH3基因?qū)毎掣?、細胞運動、細胞形態(tài)發(fā)生、細胞內(nèi)運輸、囊泡運輸?shù)绕鹬匾恼{(diào)控作用［27～29］，近年來，隨著分子遺傳學(xué)、細胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、生物信息學(xué)等的發(fā)展，DIAPH3 基因及其對ANSD 影響的相關(guān)研究逐漸深入。然而尚有許多問題亟待解決，如DIAPH3 基因在內(nèi)耳的精確表達模式和具體表達部位尚不清楚；5，UTR區(qū)c.－172G＞A 突變致DIAPH3 基因過表達的機制目前仍是個謎；DIAPH3 基因過表達如何導(dǎo)致ANSD 的機制仍停留在假說水平，并且DIAPH3基因的長期效應(yīng)還有待進一步研究。DIAPH3 基因的相關(guān)研究將為ANSD 的發(fā)病機理、病理分型、治療方式的選擇、預(yù)后及可能的基因治療奠定理論基礎(chǔ)。

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