非綜合征型聾患兒SLC26A4基因突變分析＊

戴翔 李雋 胡晞江 童靜 向萍霞 劉翎 冷培

耳聾是一種嚴重影響人類生活質量的常見疾病，在世界范圍內，每1 000名新生兒中就有1名耳聾患兒，50%患兒的耳聾與遺傳因素有關［1］。在遺傳性聾中，綜合征型聾（syndromic hearing loss，SHL）占30%，非綜合征型聾（non－syndromic hearing loss，NSHL）占70%，在引起NSHL的常見致病基因中，SLC26A4基因突變是僅次于GJB2基因突變而引起常染色體隱性遺傳非綜合征型聾的致病因素［2］，與前庭水管擴大（large vestibular aqueduct，LVA）密切相關。本研究擬對137例散發(fā)非綜合征性聾患者進行SLC26A4 基因突變檢測，探討其耳聾的可能病因及SLC26A4基因突變規(guī)律。

1 資料與方法

1.1 研究對象 研究對象為經武漢市婦女兒童醫(yī)療保健中心耳鼻咽喉科確診的137例非綜合征型聾患者（耳聾組），男73例，女64例，年齡6個月～13歲，平均3.8±3.1歲。其中，雙側聾119例，單側聾18例；LVA 患者22例，其中雙側LVA 20例，單側LVA 2例。1例患者（表1 中編號111103）除聽力損失外，曾有腎母細胞瘤病史及治療史，尿液pH 值5.0，較正常范圍低，其他系統(tǒng)未見明顯異常。其他患者均無其他系統(tǒng)異常，無家族遺傳病史，無傳染病史，無耳毒性藥物應用史。選取聽力正常且其他系統(tǒng)無明顯異常者126例作為正常對照組，男女各63例，年齡3～34歲，平均12.7±10.6歲。根據(jù)知情同意原則，對受檢者采集外周血樣本以枸櫞酸鈉抗凝備查，該項目的倫理論證由武漢市婦女兒童醫(yī)療保健中心倫理委員會認可。

1.2 研究方法

1.2.1 聽功能與影像學檢查 根據(jù)受檢者年齡及配合程度，對耳聾患者分別進行純音測聽及聽性腦干反應（ABR）檢查，聽力損失程度分級標準［3］：輕度為20～40dB HL、中度為41～70dB HL、重度為71～95dB HL、極重度為＞95dB HL。對患者進行顳骨CT 檢查，從半規(guī)管總腳到前庭水管外口的1／2處直徑大于1.5mm 即診斷為LVA。

1.2.2 基因組DNA 提取與PCR 反應 應用Ge－nomic DNA Purification Kit（Promega公司）從受檢者外周血樣本中提取基因組DNA，經紫外分光光度計定量及純度分析后，保存于－20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

擴增耳聾組和正常對照組所有對象的SLC26A4基因全部21個外顯子，外顯子1的引物及PCR 反應條件參見Coyle等的研究［4］，其余外顯子的引物及反應條件參考文獻報道［5］，引物由上海生工公司合成。PCR 反應體系（50μl）：5xBuffer 10μl，dNTP 1μl，Mg2＋5μl，Taq酶1.25U，均由Promega公司提供，引物1μl，DNA 200ng，加去離子水至50μl。PCR 反應在ABI公司9700型熱循環(huán)儀上完成，PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測分析。

1.2.3 DNA 測序與數(shù)據(jù)分析 應用Cycle－Pure Kit純化試劑盒（OMEGA 公司）對PCR 產物進行純化。應用ABI公司3130型基因分析儀進行正反向直接測序，引物與PCR 引物相同。測序結果經Sequencing Analysis 5.2分析，并通過GeneTool與來自NCBI的SLC26A4基因標準序列進行比對，確定突變位點。

2 結果

137例耳聾患者中23例檢出SLC26A4基因突變，占16.79%（23／137）；119 例雙側耳聾患者中SLC26A4突變患者約占19.33%（23／119）；18例單側耳聾患者中未檢出SLC26A4基因致病突變。126例正常對照組中未檢出SLC26A4基因致病突變。

耳聾組中20 例確診為雙側LVA，2 例為單側LVA；雙側LVA 患者中SLC26A4基因突變19例，約占95.0%（19／20）（表1）；單側LVA 患者中未檢出SLC26A4基因致病突變。

表1 23例SLC26A4基因突變患者的耳聾程度、CT 顯示LVA 和基因檢測結果

本研究共發(fā)現(xiàn)11種SLC26A4基因突變，包括4種國際上尚未報道的突變：E29K（c.85G＞A）、R79X（c.235C＞T）、C282G（c.844T＞G）和V285I（c.853G＞A）（圖1）；7種已報道突變：IVS7－2A＞G、G197R、K440X、S532R、IVS15＋5G＞A、D669V 和H723R。IVS7－2A＞G 突變患者在所有SLC26A4基因突變患者中約占82.61%（19／23），在雙側LVA 患者中占89.47%（17／19）；H723R 突變在所有SLC26A4基因突變患者中約占13.04%（3／23），在雙側LVA 患者中占15.79%（3／19）；其他突變均只有一例患者。多個物種的Pendrin蛋白在進行同源性比對后，發(fā)現(xiàn)4種新發(fā)現(xiàn)的突變均位于保守區(qū)。

3 討論

SLC26A4基因定位于7q31，屬于離子轉運體家族，介導I－／Cl－的轉運［6］。小鼠動物模型研究結果顯示，SLC26A4基因最早在胚胎期11 天表達于內耳的內淋巴囊，對聽力表型的發(fā)育至關重要［7］。人類SLC26A4基因突變及其表達異常與聽力損失和內耳結構異常密切相關。SLC26A4基因突變是僅次于GJB2突變而引起常染色體隱性遺傳非綜合征型聾的致病因素，與LVA 和Pendred綜合征密切相關。本研究耳聾組中SLC26A4突變檢出率為16.79%（23／137），在雙側耳聾患者中約占19.33%（23／119），與很多報道結果相近［2，7］；Wang 等［8］研究發(fā)現(xiàn)中國的大前庭水管患者中SLC26A4基因突變檢出率為97.9%，本研究中雙側LVA 患者中SLC26A4基因突變檢出率為95%（19／20），說明SLC26A4基因突變是中國人NSHL 的常見病因，同時也是引起國人LVA 的主要病因。

SLC26A4基因突變類型繁多，分布于各個外顯子或其側翼序列，可以表現(xiàn)為一致的純合突變，也可以為任意兩種突變的組合，呈復合雜合型突變。迄今為止，在SLC26A4 基因發(fā)現(xiàn)突變位點超過200個（http：／／www.hgmd.cf.ac.uk／ac／gene.php？gene=SLC26A4），并且具有明顯的種族差異，歐洲人以L236P和T416P最為常見［9］，而中國人、日本人和蒙古人最常見的突變類型分別為IVS7－2A＞G、H723R 和L676Q［10］。本組病例檢測出的突變類型中，IVS7－2A＞G 和H723R 是國人LVA 患者中最常見的突變類型，分別占89.47%（17／19）和15.79%（3／19）。IVS7－2A＞G 位于外顯子8剪切位點的位置，即內含子7的3’末端，其突變使前體mRNA 不能正常剪接，從而導致Pendrin的翻譯發(fā)生移框或提前終止，影響Pendrin 的結構和功能［11］，這在IVS7－2A＞G 突變轉基因小鼠的研究中也得到證實［12］。H723R 突變使該位置正常的組氨酸變成精氨酸，影響Pendrin 的表達而致?。?3］。由于IVS7－2A＞G 和H723R 在國人LVA 患者中的高突變率，因此，將這兩個位點的檢查作為新生兒耳聾基因篩查的必查項目，已經成為國內學者研究的共識［5，14］。

SLC26A4基因突變的臨床表型差異很大，有時同一種突變型在歐美人群中常表現(xiàn)為LVA 合并甲狀腺腫的SHL，而在東亞人中卻常表現(xiàn)為僅合并LVA 的NSHL，少見甲狀腺異常。即使在同一種人群中，SLC26A4基因突變所引起的聽力損失程度、前庭水管擴大程度和甲狀腺異常的情況也存在差異。目前，無論是在Pendred綜合征，還是在非綜合征型LVA 中，都沒有發(fā)現(xiàn)其臨床表型與SLC26A4基因型之間的直接關系。耳聾、LVA 和甲狀腺異常的表型與SLC26A4基因突變的個數(shù)有關［15］，本研究中編號110206和120805的患者檢出單等位基因IVS7－2A＞G 雜合突變，CT 結果正常，則進一步證實單等位基因突變不足以引起LVA。有些LVA病例在SLC26A4基因外顯子編碼區(qū)及側翼序列中只檢出一個致病突變，很可能在其內含子或調控區(qū)還存在第二個不易被檢測到的致病突變；而那些沒有檢測出SLC26A4基因突變的LVA 患者的發(fā)病原因可能就更加復雜了，如：SLC26A4基因表觀遺傳改變、SLC26A4基因以外其他致病基因、病原體感染等非遺傳因素［15］。本研究中，僅有一例雙側LVA 患者未檢出SLC26A4基因突變，其病因可能為上述因素中的一種，也可能為多種因素共同作用所至；2例患者（編號為110301和110801）檢出單個SLC26A4基因突變，由于沒有CT 結果而無法證實是否為LVA，且檢出突變是否為致病突變仍未確定，因此，這2例患者的耳聾病因是否與SLC26A4基因突變有關還有待進一步研究。另外，2 例單側LVA 患者均未檢出SLC26A4基因突變，目前，尚無研究證明單側LVA 與SLC26A4 基因突變有關。本研究中的19 例雙側LVA 均檢出雙等位基因SLC26A4突變，其聽力損失程度為中度到極重度，均未見甲狀腺異常；1例患者（編號120503）基因型為IVS7－2A＞G／G197R 復合雜合突變，聽力損失為中度，其CT 顯示的LVA 不象典型的LVA 那樣前庭水管外口大而中段小，反而是外口小于中段。

SLC26A4基因突變型與臨床表型的多樣性，說明該疾病的發(fā)病機制復雜，還有待深入研究。另外，值得一提的是，SLC26A4基因在腎臟中也有表達，然而在由SLC26A4基因突變導致耳聾的患者中卻很少見腎功能明顯異常，提示在腎臟中，依賴Pendrin的離子轉運受到其他機制的保護［16］。本研究中1例LVA 患者（編號111103）曾患有腎母細胞瘤，經手術治療后病情穩(wěn)定，其尿液pH 值5.0，較正常范圍低，是否與SLC26A4 基因突變有關還需進一步研究。

新突變的發(fā)現(xiàn)對完善國人SLC26A4基因突變圖譜具有重要意義。本研究新發(fā)現(xiàn)的基因突變中，R79X 屬無意突變，導致Pendrin 蛋白合成提前終止，是明確的致病突變；E29K 屬錯義突變，并且和R79X 在同一個明確LVA 表型的患者中形成復合雜合突變，屬致病突變的可能性極大；C282G 和V285I均屬錯義突變，且均位于保守區(qū)，同時在126例正常對照組中未檢出，可能屬致病突變，然而攜帶這兩種突變的患者均屬于單等位基因突變，且是否為LVA 無法確定，其致病性有待進一步研究。今后的工作將圍繞新突變展開功能研究，為闡明SLC26A4基因突變的致病機制提供依據(jù)，并為完善耳聾分子診斷奠定基礎。

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