響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助提取太子參多糖工藝研究

林志娟，陳 永* ，尤麗彤，孫鳳祥，李桂芝

1濰坊醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院;2 濰坊醫(yī)學(xué)院2008 級(jí)藥學(xué)專業(yè)，濰坊261053

太子參，又名孩兒參、童參，為石竹科多年生植物異葉假繁縷［Pseudostellaria hetero phylla (Miq.)Pax ex Pax et Hoffm.］的塊根，具有益氣健脾、生津潤肺之功效，臨床常用于脾虛體倦、食欲不振、病后虛弱、氣陰不足。實(shí)驗(yàn)研究表明太子參多糖是其主要藥物活性成分之一，具有抗疲勞、抗應(yīng)激和增強(qiáng)機(jī)體免疫功能等作用［1，2］，同時(shí)對(duì)由四氧嘧啶導(dǎo)致的糖尿病小鼠具有顯著治療作用［3］，具有較高的開發(fā)和應(yīng)用價(jià)值。然而，目前關(guān)于太子參多糖提取方法工藝的研究相對(duì)較少。

超聲波提取是利用超聲波具有的機(jī)械效應(yīng)、空化效應(yīng)及熱效應(yīng)，通過增大介質(zhì)分子的運(yùn)動(dòng)速度，增大介質(zhì)的穿透力以提取天然產(chǎn)物有效成分的方法。具有提取時(shí)間短、提取效率高等優(yōu)點(diǎn)［4］。

目前，多糖提取工藝優(yōu)化多為均勻設(shè)計(jì)和正交設(shè)計(jì)，此類方法不能考察因素之間的相互作用，同時(shí)也很難考察多個(gè)響應(yīng)值與因素之間的交互作用關(guān)系。響應(yīng)面分析法(response surface methodology，RSM)是一種尋找多因素系統(tǒng)中最佳條件的數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)方法。通過局部實(shí)驗(yàn)回歸擬合因素與結(jié)果間的全局函數(shù)關(guān)系，從而得到準(zhǔn)確有效的實(shí)驗(yàn)結(jié)論，能在整個(gè)考察區(qū)域上確定各個(gè)因素的最佳組合及最優(yōu)響應(yīng)值。響應(yīng)曲面法以其試驗(yàn)次數(shù)少周期短，求得的回歸方程精度高，能研究幾種因素間交互作用的諸多優(yōu)點(diǎn)［5］，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于工藝條件優(yōu)化等領(lǐng)域。本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)曲面法進(jìn)一步優(yōu)化太子參多糖超聲輔助提取工藝，以期得到最佳提取工藝參數(shù)，為太子參多糖的進(jìn)一步開發(fā)利用提供依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

太子參，購自濰坊本草閣大藥房，60 ℃烘干，粉碎，過100 目篩。濃硫酸、苯酚、葡萄糖、三氯甲烷、正丁醇均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

WKX-230 風(fēng)選中藥粉碎機(jī):山東青州市精誠機(jī)械制造有限公司;KQ-100DB 型數(shù)控超聲清洗器:昆山市超聲儀器有限公司;HC-3018 高速離心機(jī):安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司;722S 可見分光光度計(jì):上海棱光技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 太子參多糖提取工藝

準(zhǔn)確稱取太子參粉10 g，按比例加入蒸餾水浸泡3 h，按試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行超聲浸提。提取液70 ℃減壓濃縮，離心除去沉淀，Sevage 法脫蛋白3 次，蒸餾水透析24 h，然后加入3 倍體積無水乙醇沉淀過夜，離心，沉淀用無水乙醇、丙酮洗滌，干燥后得太子參多糖。

1.3.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備—苯酚硫酸法［6］

精密稱取105 ℃干燥至恒重的無水葡萄糖100 mg，定容至1000 mL，搖勻即得0.10 mg/mL 的葡萄糖溶液，作為標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密量取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 mL 分別置于具塞試管中，分別加水至0.5 mL，空白對(duì)照為蒸餾水0.5 mL，各加5 %苯酚(重蒸)溶液0.5 mL，混勻，加濃硫酸2.5 mL，迅速振搖混勻，于室溫下放置30 min，490 nm 處比色，以吸光度(A)為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 多糖測(cè)定及提取得率計(jì)算

精密稱取干燥至恒重的太子參多糖樣品10 mg溶于適量蒸餾水中，100 mL 容量瓶定容，既得0.1 mg/mL 多糖溶液。吸取多糖溶液0.5 mL 至具塞試管中，苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量，按多糖提取得率(% )= (多糖質(zhì)量/樣品質(zhì)量)×100 %計(jì)算太子參多糖提取得率。

1.3.4 多糖提取的單因素試驗(yàn)

以提取時(shí)間45 min，提取溫度70 ℃，超聲波功率80%，液料比20∶1 為基本條件，分別考察超聲波功率、提取時(shí)間、提取溫度及水料比各單因素變化對(duì)多糖提取得率的影響。

1.3.5 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案［7-9］，進(jìn)一步優(yōu)化超聲法提取太子參多糖的條件。試驗(yàn)以太子參多糖提取得率為響應(yīng)值(Y)，分別用X1、X2、X3表示提取溫度、提取時(shí)間和水料比3 個(gè)自變量，并以-1、0、1 分別表示3 個(gè)水平，按方程xi=(Xi-X0)/△X 對(duì)自變量進(jìn)行編碼。式中:xi為自變量的編碼值;Xi為自變量的真實(shí)值;X0為試驗(yàn)中心點(diǎn)處自變量的真實(shí)值;△X 為自變量的變化步長。試驗(yàn)因素及水平編碼如表1 所示，具體試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案見表2。

表1 太子參多糖提取得率響應(yīng)面分析因素水平及編碼Table 1 Variables and levels of response surface analysis

表2 Box-Behnken 設(shè)計(jì)方案及太子參多糖提取得率測(cè)定值Table 2 Box-Behnken design matrix and extraction yield of Radix Pseudostellariae polysaccharides

采用Design-Expert.v.8.0.5 對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，擬合二次多項(xiàng)式方程，方程可靠性由R2表達(dá)，其統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性由F 值檢驗(yàn)。影響因素線性效應(yīng)、平方效應(yīng)及其交互效應(yīng)的顯著性由模型系數(shù)的P 值檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 超聲波功率

由圖1 可以看出在其它條件不變的情況下，隨著超聲波功率的增大，太子參多糖的提取得率逐步提高，當(dāng)功率達(dá)到100 W 時(shí)多糖提取得率達(dá)到最大值，為傳統(tǒng)水提法(即超聲波功率為0 時(shí)太子參多糖的提取得率)的1.85 倍，表明在儀器額定功率范圍內(nèi)，隨超聲波功率的增大，太子參多糖提取得率逐步提高。因此，在試驗(yàn)中為提高多糖提取得率，將超聲功率設(shè)為100 W 的額定功率。

圖1 超聲波功率對(duì)提取得率的影響Fig.1 Effects of ultrasonic power on the extraction yield

2.1.2 提取時(shí)間

在保持其它條件不變，改變提取時(shí)間時(shí)，太子參多糖提取得率的變化情況如圖2 所示。有圖可見，在提取時(shí)間小于60 min 時(shí)，隨提取時(shí)間的延長，提取效率提高顯著，隨后再延長提取時(shí)間，提取得率不再增加，且略有降低。這表明多糖的浸出過程與時(shí)間密切相關(guān)，時(shí)間過短，多糖溶解不充分;而達(dá)到一定的提取時(shí)間后，原料中多糖已充分浸出，故得率不再增加。但時(shí)間過長，又會(huì)引起多糖結(jié)構(gòu)的變化進(jìn)而使得率降低。為縮短工時(shí)、減少能耗，太子參多糖的提取時(shí)間選擇60 min 左右較為合適。

圖2 提取時(shí)間對(duì)提取得率的影響Fig.2 Effects of extraction time on the extraction yield

2.1.3 提取溫度

其它條件不變，考察提取溫度對(duì)多糖提取得率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，提取溫度小于70 ℃時(shí)，隨著提取溫度的升高，太子參多糖提取得率明顯增加，而溫度大于70 ℃后，多糖提取得率有所下降，如圖3 所示?？赡苁歉邷貤l件下部分多糖水解的結(jié)果，這也與大多數(shù)多糖提取工藝研究結(jié)果一致，因此太子參多糖的提取溫度選擇70 ℃左右為宜。

圖3 提取溫度對(duì)提取得率的影響Fig.3 Effects of extraction time on the extraction yield

2.1.4 水料比對(duì)太子參多糖提取得率的影響

其它條件不變，考察水料比對(duì)多糖提取得率的影響，結(jié)果如圖4 所示，隨水料比的增大多糖提取得率有增加的趨勢(shì)，水料比大于25 mL/g 后多糖提取得率下降。分析原因?yàn)樘崛∫哼^少時(shí)多糖提取不充分導(dǎo)致提取得率過低，提取液比例過大時(shí)，超聲波輻射被溶劑大量吸收，不能完全作用于物料，從而影響多糖提取得率。因此太子參多糖提取的水料比為25 mL/g 左右時(shí)能獲得最高的提取得率。

圖4 水料比對(duì)提取得率的影響Fig.4 Effects of liquid to solid ratio on the extraction yield

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 二次回歸模型擬合及方差分析

各處理組合的試驗(yàn)結(jié)果見表2，應(yīng)用Design-Expert 7.0 軟件對(duì)表2 的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合獲得太子參多糖提取得率(Y)對(duì)提取溫度(X1)、提取時(shí)間(X2)、水料比(X3)3 個(gè)自變量的二次多項(xiàng)式回歸方程為:Y= 2.35 +0.32x1+0.11x2+0.096x3-0. 068x1x2+ 0. 077x1x3-0. 035x2x3-0. 42x-0. 18x-0.30x對(duì)回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

由表3 可知，模型的F 檢驗(yàn)結(jié)果為P ＜0.0001，表明該回歸模型極其顯著，且模型失擬項(xiàng)P =0.1034 ＞0.05 不顯著，復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.9846，說明模型擬合程度很好。校正系數(shù)R2=0.9475 說明該模型能解釋94.75%響應(yīng)值的變化，僅有總變異的5.25%不能用此模型來解釋。因此試驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值非常接近，可以用此模型來分析和預(yù)測(cè)超聲法提取太子參多糖的工藝條件。由表3 中回歸模型的方差結(jié)果分析可知，提取溫度、提取時(shí)間、水料比3因素對(duì)多糖提取得率均有顯著影響，它們對(duì)提取得率的影響排序?yàn)樘崛囟?X1)＞提取時(shí)間(X2)＞水料比(X3)。

表3 回歸模型方差分析表Table 3 Analysis of variance with regression model

2.2.2 響應(yīng)面交互作用分析與優(yōu)化

為了進(jìn)一步研究相關(guān)變量之間的交互作用以及確定最優(yōu)點(diǎn)，我們通過Design-Expert 軟件繪制了響應(yīng)面曲線圖，見圖5～7。比較響應(yīng)面三維圖可知，在所選范圍內(nèi)存在極值，即響應(yīng)面最高點(diǎn)。圖5 表明，提取溫度低、時(shí)間短時(shí)，多糖提取得率低;但過高的提取溫度、過長的提取時(shí)間會(huì)導(dǎo)致多糖提取得率的下降，這可能是由于時(shí)間長，溫度高使多糖分解所致，規(guī)律與單因素試驗(yàn)基本一致。

圖7 提取時(shí)間與水料比對(duì)太子參多糖提取得率的響應(yīng)面圖Fig.7 Three-dimensional response surface plot of mutual effects of extraction time and liquid/solid ratio on extraction yield

由圖5、圖6 及圖7 響應(yīng)面立體圖可以看出，響應(yīng)值存在極值，即響應(yīng)面最高點(diǎn)，進(jìn)一步通過Design-Expert 軟件分析計(jì)算可知，當(dāng)提取溫度為73.8℃，提取時(shí)間為63.5 min，水料比為25.9 mL/g 時(shí)，太子參多糖提取得率達(dá)到最大值，為2.43%?？紤]到實(shí)驗(yàn)的可操作性，把上述條件修正為提取溫度為74 ℃，提取時(shí)間為65 min，水料比為26 mL/g，并設(shè)超聲波功率為100 W。

在修正條件下對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，重復(fù)3 次，得到太子參多糖平均提取得率為2.48%相對(duì)預(yù)測(cè)值誤差為2.1%，二者非常接近，說明該工藝穩(wěn)定可行，適合太子參多糖提取。

3 結(jié)論

本研究首先通過單因素實(shí)驗(yàn)選定了參與響應(yīng)面試驗(yàn)的提取時(shí)間、水料比以及提取溫度3 個(gè)主要因素并設(shè)立不同水平，然后應(yīng)用響應(yīng)面分析法建立了影響太子參多糖提取得率的二次多項(xiàng)數(shù)學(xué)模型，經(jīng)檢驗(yàn)該模型具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可用于生產(chǎn)預(yù)測(cè)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明提取溫度、提取時(shí)間及水料比各因素及其二次項(xiàng)對(duì)多糖提取得率均有顯著影響。綜合考慮各方面的因素，超聲輔助提取太子參多糖的優(yōu)化條件是:提取溫度為74 ℃，提取時(shí)間為65 min，水料比為26 mL/g，超聲波功率為100 W，此條件下太子參多糖的提取得率可達(dá)2.48%。該結(jié)果可為太子參多糖提取的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論參考依據(jù)。

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