番茄葉水提物急性毒性及其對(duì)急性炎癥的影響

閻 莉，鄧家剛，衛(wèi)智權(quán)

廣西中藥藥效研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室廣西中醫(yī)藥大學(xué)，南寧530001

番茄葉為茄科多年生草本植物番茄(Lycopersicon esculentum Mill)的葉，具有特殊氣味，這些氣味來(lái)自一些特殊的天然揮發(fā)性成分，主要為β-水芹烯、3-己烯醇、2-己烯酮、2-己烯醇及2-甲基-N-苯基-2-丙烯酰胺(5)、鄰苯二甲酸丁基(8-甲基壬基)二酯(10)等罕見(jiàn)的含氮化合物［1，2］。雖然體外研究顯示番茄葉提取物可抑制某些病原微生物［3］，但其是否對(duì)病原微生物感染引起的急性炎癥具有抗炎作用則未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究以脂多糖誘導(dǎo)急性炎癥大鼠為研究對(duì)象，觀察番茄葉水提物的急性毒性及其對(duì)脂多糖誘導(dǎo)急性炎癥的影響，初步評(píng)估番茄葉水提物的抗急性炎癥活性。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)昆明種小鼠，體重18～22 g，雌雄各半，購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK 桂2003-0003)。SPF 級(jí)健康雄性SD 大鼠60只，體重220～240 g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(湘)2009-0004)。

1.2 藥品及試劑

番茄葉來(lái)源于廣西百色國(guó)家農(nóng)業(yè)科技園區(qū)優(yōu)質(zhì)無(wú)公害蔬菜產(chǎn)業(yè)化示范園。干燥、粉碎后經(jīng)水提取、濃縮3 次后得到流浸膏(每mL 相當(dāng)于原生藥3.226 g)，備用。戊巴比妥鈉，北京化學(xué)試劑公司產(chǎn)品。醋酸潑尼松片，浙江仙琚制藥股份有限公司產(chǎn)品。大腸桿菌脂多糖，美國(guó)Sigma 公司產(chǎn)品(血清型O55:B5)。白細(xì)胞介素1(IL-1)、白細(xì)胞介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)的ELISA 試劑盒均為美國(guó)R＆D 公司產(chǎn)品(201011)。

1.3 儀器設(shè)備

Multiskan MK3 酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司產(chǎn)品。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)

用SPF 級(jí)小鼠進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)。經(jīng)預(yù)試驗(yàn)確定其最大致死劑量為90 g/kg，最小致死劑量為20 g/kg，以90 g/kg 為初始劑量，以1∶0.75 為組距設(shè)定6 個(gè)組。動(dòng)物禁食不禁水12 h 后，一次灌胃給藥，給藥容積40 mL/kg，連續(xù)觀察14 d，每日記錄小鼠的毒性反應(yīng)及死亡數(shù)，按改良寇氏法計(jì)算半數(shù)致死量(LD50)。

2.2 番茄葉水提物對(duì)血清炎癥細(xì)胞因子水平的影響

以1/10 LD50劑量和1/20 LD50劑量為番茄葉水提取物高劑量(3.19g/kg，TLAE-H)和低劑量(1.59 g/kg，TKAE-L)。50 只大鼠分為正常組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照藥物潑尼松(PNS，5 mg/kg)組、TLAE-H 組和TKAE-L 組。每組10 只，均灌胃給藥。給藥第9 天后，腹腔注射LPS(4 mg/kg)建立急性炎癥動(dòng)物模型。12 h 后以2%戊巴比妥鈉40 mg/kg 腹腔注射麻醉，下腔靜脈穿刺取血，室溫靜置30 min 后于4oC 離心(4000 rpm，5 min)，分離血清，凍存于-70oC備測(cè)血清IL-1、IL-6、TNF-α。

采用IL-1、IL-6、TNF-α 的ELISA 檢測(cè)試劑盒，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。以Expert Curve 1.3.8 曲線(xiàn)擬合軟件計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的直線(xiàn)回歸方程，分別計(jì)算樣品濃度。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有計(jì)量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x ±s)表示，以SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行多個(gè)樣本間均數(shù)比較，以P ＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)

給藥后小鼠出現(xiàn)自由活動(dòng)減少，精神萎靡，身毛豎起，反應(yīng)遲鈍，靜臥不動(dòng)等癥狀，并有死亡情況發(fā)生。結(jié)果參見(jiàn)表1。按改良寇氏法計(jì)算，番茄葉水提物單次灌胃給藥的LD50為46.44 g/kg，其95%可信限為39.52～54.60 g/kg。

表1 口服不同劑量番茄葉水提物的小鼠死亡率Table 1 Mortality of mice with different doses of oral TLAE

3.2 番茄葉水提物對(duì)血清炎癥細(xì)胞因子水平的影響

腹腔注射LPS 后，大鼠血清炎性細(xì)胞因子IL-1、IL-6、TNF-α 水平均明顯增加而顯著高于正常組(P均＜0. 01)。PNS 組、TLAE-H 組血清IL-1、IL-6、TNF-α 水平均明顯低于模型組，TLAE-L 組血清IL-1、IL-6 水平低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01 或P ＜0.05)。而TLAE-L 組血清TNF-α 水平雖然略低于模型組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠血清IL-1、IL-6、TNF-α 水平(n=10，±s)Table 2 Levels of rat serum IL-1，IL-6and TNF-α in each group (n=10，±s)

表2 各組大鼠血清IL-1、IL-6、TNF-α 水平(n=10，±s)Table 2 Levels of rat serum IL-1，IL-6and TNF-α in each group (n=10，±s)

組Group劑量Does(g/kg)IL-1(ng/L)IL-6(ng/L)TNF-α(ng/L)正常組Control－297.86 ±81.46282.88 ±54.0239.95 ±9.62模型組Model0.004381.00 ±78.26▲▲357.41 ±63.23▲▲53.70 ±10.34▲▲

注:與空白組比較，▲▲P ＜0.01;與模型組比較，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。Note:Compared with control，▲▲P ＜0.01.Compared with PNS，* P ＜0.05;＊＊P ＜0.01.

4 討論

中國(guó)是最主要的番茄及其副產(chǎn)品生產(chǎn)國(guó)之一，番茄葉資源極為豐富，然而番茄葉一直作為農(nóng)業(yè)廢棄物處置而未加以利用［4］。番茄葉的化學(xué)成分較復(fù)雜，國(guó)內(nèi)外對(duì)其研究甚少，主要研究了其揮發(fā)性氣味組成［1，2］，但對(duì)其水溶性成分的化學(xué)及藥理研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

體外抑菌藥理研究顯示，番茄葉丙酮提取物對(duì)多種病原微生物具有較強(qiáng)的抑菌作用［3］。然而，番茄葉水提物對(duì)這些常見(jiàn)致病菌感染導(dǎo)致的急性感染性炎癥是否具有抗炎活性仍未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。對(duì)番茄葉進(jìn)行抗炎活性研究，有助于農(nóng)業(yè)廢棄物的開(kāi)發(fā)利用，變廢為寶，有利于農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

革蘭陰性菌外膜的LPS 是介導(dǎo)急性感染性炎癥損傷的最主要的病原分子之一，許多疾病與LPS誘導(dǎo)的炎癥密切相關(guān)［5，6］。LPS 進(jìn)入血液循環(huán)后可迅速導(dǎo)致IL-1、IL-6、TNF-α 等炎性細(xì)胞因子的大量表達(dá)并釋放入血，可以作為評(píng)價(jià)LPS 誘導(dǎo)的急性炎癥的參照指標(biāo)［7，8］。本研究中，模型組大鼠接受LPS注射后其血清IL-1、IL-6、TNF-α 水平均顯著上升，提示LPS 成功誘導(dǎo)了具有急性炎癥的大鼠模型。TLAE-H 與TLAE-L 組大鼠血清IL-1、IL-6 水平均明顯低于模型組，但僅在TL-H 組觀察到血清TNF-α的明顯降低，此結(jié)果一方面表明番茄葉水提物具有較明顯的抑制LPS 誘導(dǎo)急性炎癥的作用，另一方面也提示番茄葉水提物對(duì)于不同的炎性細(xì)胞因子其作用強(qiáng)度可能存在差別。鑒于IL-1、IL-6 可由多種細(xì)胞合成，包括活化的T 細(xì)胞和B 細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等，而TNF-α 則主要由單核-巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，上述差異的產(chǎn)生是否緣于番茄葉水提物對(duì)不同細(xì)胞的作用的差別，需要更多的實(shí)驗(yàn)證據(jù)加以證實(shí)。

按改良寇氏法計(jì)算，本研究中番茄葉水提物單次灌胃給藥的LD50為46.44 g/kg，其95%可信限為39.52～54.60 g/kg，而本研究所用的最高劑量?jī)H為3.19g/kg，兩者之間巨大的劑量差距表明，較小劑量的番茄葉水提物在發(fā)揮抑制LPS 誘導(dǎo)急性炎癥的藥理作用時(shí)仍然具有良好的安全性。然而，包括長(zhǎng)期毒性研究在內(nèi)的更多的安全性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)證據(jù)將能夠提供對(duì)番茄葉水提物更合理的安全性評(píng)價(jià)結(jié)論。

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