香砂六君子湯對(duì)脾氣虛證大鼠腸神經(jīng)-ICC間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路損傷的作用

丁伯龍，齊清會(huì)

Cajal間質(zhì)細(xì)胞（interstitial cells of Cajal，ICC）為胃腸道的起搏細(xì)胞，具有胃腸基本節(jié)律和起搏功能，參與腸神經(jīng)系統(tǒng)（enteric nerve system, ENS）信號(hào)向平滑肌細(xì)胞（smooth muscle cells, SMC）的轉(zhuǎn)導(dǎo)。ENS 運(yùn)動(dòng)末梢、ICC、SMC 構(gòu)成胃腸運(yùn)動(dòng)的基本功能單位[1-2]，蛋白激酶A（protein kinase A,PKA）、蛋白激酶C（protein kinase C,PKC）是細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵的信號(hào)分子，PKA/PKC活性的改變會(huì)對(duì)胃腸運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生很大的影響[3]。本實(shí)驗(yàn)以苦寒泄瀉、耗氣破氣致脾氣虛證模型大鼠為研究對(duì)象，觀察脾氣虛證模型和香砂六君子湯治療后大鼠腸神經(jīng)-ICC 間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的表達(dá)改變，探討香砂六君子湯治療脾氣虛證胃腸運(yùn)動(dòng)障礙的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 健康成年Wistar大鼠100只，雌雄各半，體質(zhì)量約200～220 g。由大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。（合格證號(hào)：SCXK(遼)2008-0002）

1.2 藥物和試劑 山羊抗大鼠c-kit 多克隆抗體（santa cruz, biotech，USA）；兔抗大鼠PKA 多克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司）；小鼠抗大鼠PKC 多克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司）；FITC-驢抗山羊IgG 抗體（santa cruz, biotech, USA）；CY3-山羊抗兔IgG 抗體（sabta cruz, biotech, USA）；CY3-山羊抗小鼠IgG 抗體（santa cruz, biotech,USA）；牛血清白蛋白（BSA）(sigma, USA)；熒光封片劑（vector lab, USA）。中藥香砂六君子湯、脾氣虛造模用藥均購(gòu)自大連同仁堂，香砂六君子湯成分為：黨參10 g，白術(shù)9 g，甘草6 g，茯苓9 g，半夏12 g，陳皮9 g，香附6 g，砂仁6 g。

1.3 儀器 TCS-Sp5 激光掃描共聚焦顯微鏡（leica, Germany）；圖像分析軟件（leica confocal software, Germany）；SMZ800解剖顯微鏡（nikon, Japan）；顯微解剖鑷（regineepoxy, Swiss）。

1.4 方法

1.4.1 脾氣虛證模型制作和分組 將100 只Wistar大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組20只，模型組30只，恢復(fù)組20只，治療組30只。脾氣虛證動(dòng)物模型制作參考陳小野[4]的苦寒泄瀉和耗氣破氣相結(jié)合的方法。⑴用生大黃、厚樸、枳實(shí)（2∶1∶1）制成200%濃度煎劑。⑵用廣豆根、旋復(fù)花、檳榔（3∶1∶1）制成250%濃度煎劑，藥溫為4 ℃。⑴和⑵交替灌胃，造模前18 d，3次/d，后12 d，4 次/d，每次4 mL。動(dòng)物表現(xiàn)出外觀差、蜷縮、活動(dòng)減少、反應(yīng)遲鈍、閉眼、毛色晦暗無(wú)光澤、四肢無(wú)力、腹瀉、體質(zhì)量下降等脾氣虛癥狀，提示脾氣虛模型制造成功。對(duì)照組用相同劑量的蒸餾水，飲食不限，飼養(yǎng)30 d。造模成功，將脾氣虛證動(dòng)物分成3組：⑴模型組。⑵治療組，香砂六君子湯水煎劑2 mL/（100 g體質(zhì)量·d），灌服2周。③恢復(fù)組，造模成功后按治療組方法灌服等量蒸餾水2周。

1.4.2 小腸組織共聚焦顯微鏡檢測(cè) 參照Iino S等[5]方法制備小腸肌層全厚標(biāo)本和免疫熒光標(biāo)記。造模成功后大鼠脫頸處死，取大鼠上段小腸組織作腸肌層全厚標(biāo)本。隨后進(jìn)行免疫熒光標(biāo)記：⑴將標(biāo)本放于0.5%TritonX-100 的0.05 M Tris-HCL 緩 沖 液（pH7.6）37 ℃孵育4 h。⑵0.01M PBS 漂洗3 次后滴加1%BSA，孵育1 h。⑶0.01 M PBS 漂洗后滴加山羊抗大鼠c-kit多克隆抗體、兔抗大鼠PKA多克隆抗體、小鼠抗大鼠PKC 多克隆抗體，4 ℃避光孵育48 h。⑷0.01M PBS 漂洗后依次滴加FITC-驢抗山羊IgG抗體、CY3-山羊抗兔IgG抗體、CY3-山羊抗小鼠IgG 抗體，室溫下避光孵育2 h。⑸0.01 M PBS 漂洗后將標(biāo)本0.1%多聚賴(lài)氨酸包被的載玻片上，熒光封片劑封片后用于激光掃描共聚焦顯微鏡觀測(cè)。⑹陰性對(duì)照組在步驟⑶中不添加一抗，只用抗體稀釋液，余操作步驟同上。

1.5 圖像采集 以適合于FITC（488 nm）和適合于CY3（543）的激發(fā)波長(zhǎng)來(lái)觀測(cè)標(biāo)本，圖像采集的顯微鏡為200倍。每組取5個(gè)標(biāo)本檢測(cè)，每一標(biāo)本隨機(jī)選取2 個(gè)視野，用EZ-C13.70 圖像分析軟件進(jìn)行圖像三維重建，用Image-Pro Plus 6.0 進(jìn)行半定量分析。其中PKA、PKC 陽(yáng)性熒光為紅色，c-kit 陽(yáng)性熒光為綠色。

1.6 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 13.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，采用方差分析，P＜0.05表示有顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 小腸大體標(biāo)本肉眼所見(jiàn) 對(duì)照組：胃腸形態(tài)正常，腸管呈粉紅色，無(wú)粘連，可見(jiàn)到胃腸蠕動(dòng)波。模型組：腸管廣泛積氣，漿膜層充血水腫，呈暗紅色，鮮見(jiàn)胃腸蠕動(dòng)波，并可見(jiàn)少量淡血性腹水。恢復(fù)組：腸管內(nèi)有較多腸內(nèi)容物，并伴有輕度積氣，腸管壁呈輕度淤血表現(xiàn)，腸蠕動(dòng)減弱。治療組：胃腸道內(nèi)有較少量的內(nèi)容物儲(chǔ)存，胃腸壁及其系膜無(wú)水腫，腸管色澤紅潤(rùn)，并可見(jiàn)到胃腸蠕動(dòng)波。

2.2 激光掃描共聚焦顯微鏡檢測(cè)

2.2.1 小腸肌層ICC、PKA信號(hào)通路表達(dá) 對(duì)照組：在肌間可見(jiàn)豐富的ICC分布，且較均勻，細(xì)胞大部分呈雙極形，胞體飽滿(mǎn)，彼此相互連接成網(wǎng)絡(luò)樣結(jié)構(gòu)，ICC周?chē)胸S富的PKA分布。模型組：ICC數(shù)量明顯減少，相互連接明顯減少，完整的網(wǎng)絡(luò)樣結(jié)構(gòu)遭到明顯的破壞，細(xì)胞熒光IOD值明顯降低，周?chē)梢?jiàn)散在的PKA分布?；謴?fù)組：ICC數(shù)量較模型組有所增多，偶爾可見(jiàn)到相互連接，網(wǎng)絡(luò)樣結(jié)構(gòu)遭到明顯破壞，細(xì)胞熒光IOD值較模型組有所升高，其周?chē)鶳KA表達(dá)較少。治療組：在肌間可見(jiàn)豐富的ICC，分布較均勻，ICC細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰，可見(jiàn)到完整的網(wǎng)絡(luò)樣結(jié)構(gòu)，其周?chē)梢?jiàn)較多的PKA分布。具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠小腸肌層ICC、PKA信號(hào)通路表達(dá)分析(x±s)

2.2.2 小腸肌層ICC、PKC 信號(hào)通路的表達(dá) 對(duì)照組：在肌間以及可見(jiàn)豐富的ICC分布，且較均勻，ICC結(jié)構(gòu)清晰，通過(guò)彼此發(fā)出的多個(gè)突觸樣結(jié)構(gòu)相互連接成完整的網(wǎng)絡(luò)樣結(jié)構(gòu)，在ICC 的胞體和突觸周?chē)胸S富的PKC 分布，密度均勻（圖1A）。模型組：ICC數(shù)量明顯減少，相互連接明顯減少，完整的網(wǎng)絡(luò)樣結(jié)構(gòu)遭到破壞，熒光IOD值明顯降低，周?chē)梢?jiàn)較少的PKC分布，且分布不均勻（圖1B）。恢復(fù)組：ICC數(shù)量較模型組有所增加，偶爾可見(jiàn)到相互連接，網(wǎng)絡(luò)樣結(jié)構(gòu)遭到破壞，細(xì)胞熒光IOD值有所增加，ICC胞體和突觸上可見(jiàn)散在不均勻的PKC分布（圖1C）。治療組：在肌間可見(jiàn)較多的ICC分布，并通過(guò)其發(fā)出的突觸相互連接成網(wǎng)絡(luò)樣結(jié)構(gòu)，在ICC的胞體和突觸周?chē)梢?jiàn)較多的PKC 分布（圖1D）。具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。

圖1 各組大鼠小腸肌層ICC網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和PKC（表達(dá)綠色標(biāo)記為ICC，紅色標(biāo)記為PKC）

3 討論

中醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為，脾臟的生理功能主要有主運(yùn)化，化生水谷精微，為后天之本，氣血化生之源?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，脾的功能主要包括了消化吸收、內(nèi)分泌、代謝、血液、免疫等多系統(tǒng)功能。其中脾主運(yùn)化為其所有功能的基礎(chǔ)。脾氣虛時(shí)其主運(yùn)化功能減退，會(huì)出現(xiàn)納呆、便溏、腹脹、精神倦怠、面色萎黃等。在消化系統(tǒng)，脾氣虛證會(huì)導(dǎo)致消化系統(tǒng)運(yùn)動(dòng)功能和內(nèi)分泌功能的改變，主要表現(xiàn)為胃腸運(yùn)動(dòng)功能的改變。ICC 是胃腸起搏細(xì)胞，并具有傳遞神經(jīng)遞質(zhì)的作用。近年來(lái)的研究表明，胃腸神經(jīng)-ICC-平滑肌網(wǎng)絡(luò)之間存在著密切的聯(lián)系，ICC 在伸進(jìn)信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著重要的作用[6]。胃腸神經(jīng)沖動(dòng)信號(hào)激活腸神經(jīng)系統(tǒng)釋放相應(yīng)的神經(jīng)遞質(zhì)，活化的神經(jīng)遞質(zhì)與ICC 上特定神經(jīng)遞質(zhì)受體相結(jié)合。ICC 將所接收到的神經(jīng)加以整合分析，再通過(guò)與平滑肌細(xì)胞之間的縫隙連接，將神經(jīng)信號(hào)傳遞至平滑肌細(xì)胞，平滑肌細(xì)胞活化而發(fā)生收縮或舒張[7]。ICC 細(xì)胞膜上接受傳遞抑制性神經(jīng)遞質(zhì)的受體有一氧化氮受體（sGC）、血管活性腸肽受體（VIP2-R），興奮性神經(jīng)遞質(zhì)受體主要有毒蕈堿型受體（M2-R）、神經(jīng)激肽受體（NK1-R）。其中NK1-R和M2-R屬于G蛋白偶聯(lián)受體，通過(guò)G蛋白偶聯(lián)受體-cAMP-蛋白激酶A（PKA）途徑或G蛋白-磷脂酶C（PLC）-蛋白激酶C（PKC）途徑發(fā)揮作用。而VIP和NO則可通過(guò)sGC-cGMP-PKG途徑發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。蛋白激酶A（protein kinase A,PKA）、蛋白激酶C（protein kinase C,PKC）是細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵的信號(hào)分子[8-9]。研究也已經(jīng)表明PKA、PKC活性的改變將會(huì)對(duì)胃腸運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生很大的影響[3]，脾氣虛證致大鼠胃腸運(yùn)動(dòng)障礙，蠕動(dòng)功能減退[10]。

表2 各組大鼠小腸肌層ICC、PKC信號(hào)通路表達(dá)(x±s)

為研究其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的變化，本實(shí)驗(yàn)采用c-kit和PKA/PKC抗體行免疫熒光雙標(biāo)記染色，共聚焦纖維鏡采集三維重建圖像，觀測(cè)ICC 和G 蛋白偶聯(lián)受體-cAMP-PKA途徑以及ICC和G蛋白-磷脂酶C（PLC）-PKC兩種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組大鼠小腸的ICC 網(wǎng)絡(luò)呈完整的立體的三維網(wǎng)絡(luò)樣結(jié)構(gòu)，熒光反應(yīng)清晰，ICC主要通過(guò)短的突起相互連接成網(wǎng)絡(luò)樣結(jié)構(gòu)，其周?chē)胸S富的PKA/PKC 表達(dá)。而脾氣虛證時(shí)大鼠小腸全厚肌層標(biāo)本ICC數(shù)量明顯減少，相互之間出現(xiàn)裂隙，連接結(jié)構(gòu)不連續(xù)，ICC胞體的突起數(shù)目明顯減少，熒光強(qiáng)度明顯減弱，其周?chē)磉_(dá)的PKA/PKC 數(shù)目減少，且分布不均勻。提示脾氣虛證時(shí)ICC 數(shù)目減少，ICC 網(wǎng)絡(luò)受損，胃腸起搏、電活動(dòng)的基礎(chǔ)遭到破壞，以及PKA/PKC信號(hào)傳導(dǎo)通路受損。導(dǎo)致這種表現(xiàn)得原因可能是：⑴腸管極度擴(kuò)張致使ICC 受到牽拉，ICC 網(wǎng)絡(luò)之間的連接結(jié)構(gòu)在高度的拉力下被破壞，PKA/PKC的分布伴隨著其被牽拉也發(fā)生同樣的改變。⑵脾氣虛證時(shí)，腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)被打破，隨之而出現(xiàn)的內(nèi)毒素、炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子損傷c-kit 和PKA/PKC 抗體的表達(dá)以及上述抗體和相應(yīng)抗原的結(jié)合，導(dǎo)致檢測(cè)出的ICC數(shù)量以及PKA/PKC的分布均減少。⑶脾氣虛證時(shí)，胃腸道組織間毛細(xì)血管充血，導(dǎo)致滲出增多，肌間神經(jīng)叢以及平滑肌間隙增寬，導(dǎo)致ICC及其突起、PKA/PKC相對(duì)減少。⑷脾氣虛證狀態(tài)下，ICC凋亡，細(xì)胞數(shù)目減少，PKA/PKC同樣表達(dá)減少。

香砂六君子湯為中醫(yī)健脾益氣的代表方劑，臨床運(yùn)用具有悠久的歷史，具有增強(qiáng)胃腸平滑肌的蠕動(dòng)功能，改善微循環(huán)、降低組織通透性[11-12]。應(yīng)用香砂六君子湯治療后的脾氣虛證大鼠的ICC網(wǎng)絡(luò)樣結(jié)構(gòu)基本保持完整，PKA/PKC 蛋白的表達(dá)得到恢復(fù)。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果提示，香砂六君子湯能夠修復(fù)脾氣虛證大鼠小腸ICC、及腸神經(jīng)-ICC 間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的損傷，有效改善脾氣虛證狀態(tài)下胃腸運(yùn)動(dòng)功能障礙，促進(jìn)胃腸運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)，從而有效的防治脾氣虛證。

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