伽師瓜儲(chǔ)藏期間病原菌的分類鑒定及生化特性研究

詹建立， 辛 麗， 孫 燕

(葉爾羌綠洲生態(tài)與生物資源研究實(shí)驗(yàn)室 喀什師范學(xué)院生地系，喀什 844006)

伽師瓜(Jiashimuskmelon)屬于葫蘆科(Cutrbitaceae)黃瓜屬(CucumisL.)甜瓜亞屬(MeloJeffrey)的一個(gè)甜瓜品種，因其源于新疆喀什地區(qū)伽師縣而得名。近年來(lái)，有很多學(xué)者對(duì)甜瓜病害進(jìn)行了研究。目前，全世界已發(fā)現(xiàn)的引起甜瓜采后病害的病原菌有20余種[1]。導(dǎo)致中國(guó)甜瓜貯期病害的主要病原菌為鏈格孢菌(Alternariaalternata)、青霉菌(Penicilliumspp.)、粉紅單端孢菌(Trichotheciumroseum)和鐮刀菌(Fusariumsp.)。其中，粉紅單端孢菌和鐮刀菌是常溫下發(fā)生病害的主要病原菌，鏈格孢菌和青霉菌是冷藏條件下發(fā)生病害的主要病原菌[2-4]。此外，問(wèn)亞軍等人對(duì)渭南早春拱棚甜瓜的細(xì)菌性角班病、枯萎病和霜霉病等主要病害的綜合防治技術(shù)進(jìn)行了研究[5]。新疆大學(xué)的李冠教授在甜瓜免疫性的誘導(dǎo)和抗病基因的克隆等領(lǐng)域也取得了較大的進(jìn)展[6-9]。

在甜瓜的病害研究中，對(duì)伽師瓜的研究也較多?？讘c軍等人主要對(duì)伽師瓜的抗病基因進(jìn)行了研究[10， 11]。張有林等人研究了伽師瓜采后生理和貯期病害，并探討了貯藏保鮮技術(shù)。其結(jié)論是：伽師瓜為呼吸躍變型果實(shí)，貯期病害黑斑病病原菌為叢梗孢科(Moniliaceae)青霉屬(PenicilliumLK,ex Fries)的鮮綠青霉(P.viridicatumWestling)。TBZ熏蒸和殼聚糖涂膜對(duì)PPO、POD、PE酶活性和病原菌抑制作用顯著[12]。伽師縣克孜勒博依鄉(xiāng)農(nóng)技站的阿迪力·吐?tīng)栠d等人對(duì)伽師瓜白粉病、霜霉病等病害的常規(guī)防治技術(shù)進(jìn)行了探討[13]。另外， 新疆農(nóng)科院植保所在喀什地區(qū)和阿勒泰地區(qū)建立了甜瓜病害監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)，建成了甜瓜霜霉病預(yù)測(cè)和控制的計(jì)算機(jī)技術(shù)分析平臺(tái)[14]。

本研究對(duì)伽師瓜生長(zhǎng)和貯藏期間病瓜上的微生物進(jìn)行了初步的分類鑒定，并通過(guò)細(xì)菌學(xué)檢測(cè)和Koch法則驗(yàn)證初步推斷了伽師瓜可能的病原菌。這將為伽師瓜的病害防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 伽師瓜病瓜的采集

采集生長(zhǎng)和貯藏期間的伽師瓜病瓜。

1.1.2 主要試劑

PCR preMix、EDTA-Na2、Tris、CTAB、EB、SDS和Agarose等購(gòu)自大連寶生物有限公司(TaKaRa)。16S rRNA和18S rRNA引物由上海捷瑞生物責(zé)任有限公司合成，回收DNA使用TaKaRa公司的the Gel Extraction Mini Kit (50次)。

1.2 方法

1.2.1 微生物的分離

樣品采集后制備樣品懸液：用75%的酒精擦洗病變的伽師瓜瓜皮，然后用無(wú)菌水沖洗數(shù)次，在無(wú)菌條件下選取病瓜病灶部位并放入95 mL無(wú)菌水中，振蕩10 min，制成稀釋度為10-1的菌懸液。取200 μL樣品稀釋液涂布接種于牛肉膏培養(yǎng)基、查氏培養(yǎng)基和馬丁氏培養(yǎng)基平板上，分別于37℃和28℃培養(yǎng)。

1.2.2 微生物總DNA的提取

取分離得到的微生物單個(gè)菌落進(jìn)行16S rRNA 和18S rRNA 基因序列分析。細(xì)菌總DNA的提取按照CTAB法進(jìn)行[15]。用改良 CTAB 法提取霉菌總DNA[16]。酵母總DNA的提取按照文獻(xiàn)[17]進(jìn)行。

1.2.3 病原菌16S/18S rRNA基因的擴(kuò)增

將染色體DNA作為PCR擴(kuò)增的模板。DNA擴(kuò)增反應(yīng)(25 μL反應(yīng)體系)：9.5 μL無(wú)菌水，1 μL引物1，1 μL引物2，12.5 μL rTaq酶和1 μL模板DNA。PCR反應(yīng)條件：細(xì)菌：94 ℃，30 s；55℃，30 s；72℃，2 min。真菌： 94℃，30 s；56℃，30 s；72℃，2 min。霉菌：94℃，30 s；53℃，30 s；72℃，2 min。

1.2.4 病原菌16S rRNA和18S rRNA基因克隆的產(chǎn)物純化

用DNA膠回收試劑盒對(duì)克隆基因進(jìn)行回收和純化。

1.2.5 病原菌16S rRNA和18S rRNA基因測(cè)序

擴(kuò)增產(chǎn)物直接進(jìn)行測(cè)序，委托北京奧科鼎盛有限責(zé)任公司測(cè)序。

1.2.6 病原菌16S rRNA和18S rRNA基因序列分析

測(cè)序結(jié)果通過(guò)http://www.ncbi.nih.nlm.gov網(wǎng)站進(jìn)行BLAST序列比對(duì)。同時(shí)，利用Mega 4.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.7 病原菌常規(guī)細(xì)菌學(xué)及Koch假說(shuō)測(cè)定

將伽師瓜幼苗進(jìn)行土培，接種時(shí)先用70%的酒精對(duì)幼苗葉片表面消毒，然后用針蘸取在培養(yǎng)的菌體懸液針刺和涂抹接種，各個(gè)菌株分別接3片幼苗葉片，每片幼苗葉片接種2個(gè)部位，以無(wú)菌水作對(duì)照。接種后逐日觀察發(fā)病情況。待發(fā)病后，從發(fā)病幼苗葉片進(jìn)行病原菌再分離，以進(jìn)行柯赫氏法則實(shí)驗(yàn)，獲得的純培養(yǎng)分離菌株用于進(jìn)行微生物學(xué)性狀測(cè)定。

1.2.8 病原菌的生理生化

明膠液化實(shí)驗(yàn)、甲基紅實(shí)驗(yàn)、油脂水解試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、果聚糖產(chǎn)生試驗(yàn)、接觸酶實(shí)驗(yàn)和葡萄糖氧化發(fā)酵實(shí)驗(yàn)按照文獻(xiàn)[18]進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 伽師瓜微生物的分離

通過(guò)平板稀釋涂布法，本研究從伽師瓜病瓜中初步分離得到2株細(xì)菌、3株酵母菌和8株霉菌。

2.2 伽師瓜病原菌總DNA的提取

本研究對(duì)伽師瓜病瓜上分離到的可能病原菌提取了總DNA(見(jiàn)圖1)。

圖1 伽師瓜病原菌總DNA的提取電泳圖

2.3 伽師瓜病原菌16S rRNA和18S rRNA的擴(kuò)增

伽師瓜病原細(xì)菌的16S rRNA序列擴(kuò)增結(jié)果表明，從伽師瓜病瓜上分離的細(xì)菌1、細(xì)菌2、細(xì)菌3和細(xì)菌4的16S rRNA片段得以擴(kuò)增，且片段大小約為1500 bp(如圖2)。

伽師瓜病原霉菌的18S rRNA序列擴(kuò)增結(jié)果表明，從伽師瓜病瓜上分離的霉菌1～10的18S rRNA片段得以擴(kuò)增，且片段大小約為500～750 bp之間(如圖3)。

圖2 伽師瓜病瓜分離細(xì)菌的16S rRNA基因電泳圖

圖 3 伽師瓜病瓜霉菌基因組的電泳圖

圖4 伽師瓜病瓜酵母基因組的電泳

伽師瓜病原酵母的18S rRNA序列擴(kuò)增結(jié)果表明，從伽師瓜病瓜上分離的酵母1～10的18S rRNA片段得以擴(kuò)增，且片段大小約為500～750 bp之間(如圖4)。

2.4 伽師瓜病原菌16S rRNA和18S rRNA的測(cè)定

擴(kuò)增片段經(jīng)純化后由北京奧科鼎盛有限公司測(cè)序，其中測(cè)出的可比對(duì)序列有2株細(xì)菌、8株霉菌和3株酵母菌。

圖5 伽師瓜病瓜分離菌株16S rRNA 和18S rRNA基因進(jìn)化樹(shù)

2.5 伽師瓜病原菌16S rRNA和18S rRNA的序列分析

本研究從伽師病瓜上分離到的B2細(xì)菌與Pantoeasp.Enrichmentcultureclone(EU784083)在同一個(gè)分支上，同時(shí)其與Enterobactercloacae(HQ179578)在一個(gè)大分支上。因此可以初步推斷B2細(xì)菌可能隸屬于泛菌屬(Pantoea)或腸桿菌屬(Enterobacter)，前者是農(nóng)作物的致病菌之一(見(jiàn)圖5)。

因此，本研究對(duì)從伽師病瓜上分離到的B2、B4、M1、M5、M6、M7、M10、M11、M12、M13、Y3、Y14和Y15等13株菌株進(jìn)行16S rRNA全基因序列和18S rRNA基因部分序列分析。結(jié)果表明，B2可能隸屬于泛菌屬或腸桿菌屬，B4可能隸屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)，M1可能隸屬于畢赤酵母屬(Pichia)，M11和M12可能隸屬于酵母菌屬(Pichia)或白假絲酵母屬(Candida)，M5、M7和M10青霉屬(Penicillium)，M6可能隸屬于正青霉屬(Eupenicillium)，M13可能隸屬于地霉屬(Galactomyces)，Y3和Y14可能隸屬于酵母屬(Candida)，Y15可能隸屬于真菌(fungus)。

因?yàn)榉壕鷮佟⒔湍妇鷮倩虬准俳z酵母屬和地霉屬均是果蔬的致病菌，因此，本研究初步推斷伽師瓜生長(zhǎng)和貯藏期間的可能病原菌是B2、M1、M11、M12、Y3和Y14。

2.6 伽師瓜病原菌的科赫法則驗(yàn)證和宿主確定

通過(guò)對(duì)伽師瓜病瓜樣品進(jìn)行分離純化后獲得的上述13個(gè)分離菌株分別進(jìn)行伽師瓜、甜瓜和油白菜幼苗葉片離體針刺涂抹接種。8～16 d后，伽師瓜可能病原菌B2、M1、M11、M12、Y3和Y14接種后的伽師瓜和甜瓜植株葉片周圍部分發(fā)黃、萎蔫、植株出現(xiàn)倒伏而對(duì)照植株幼苗沒(méi)變枯黃，且生長(zhǎng)良好。再次對(duì)分離到的伽師瓜和甜瓜枯黃、萎蔫的幼苗葉片的病原菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)與最初獲得的分離菌株形態(tài)相同。因此，再次推測(cè)B2、M1、M11、M12、Y3和Y14是伽師瓜的可能病原菌。同時(shí)也推測(cè)伽師瓜可能是這幾株可能病原菌的宿主，而油白菜不是其宿主。

2.7 伽師瓜病原菌的生理生化實(shí)驗(yàn)

本研究對(duì)伽師瓜病原菌進(jìn)行了明膠液化、甲基紅試驗(yàn)、油脂水解、淀粉水解、果聚糖產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)、接觸酶實(shí)驗(yàn)和糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)等生理生化實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，僅有B4、M1和M10菌株能夠液化明膠，B2、M7、M13、Y3、Y14甲基紅實(shí)驗(yàn)呈陽(yáng)性，M1、M6、M12、M13、Y3和Y14水解油脂，M1、M6、M13、Y14和Y15產(chǎn)果聚糖，B2、M11、Y14和Y15接觸酶反應(yīng)不產(chǎn)氣泡呈陰性，B4、M5、M10、Y14和Y15發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸，B4、M5、M7、M10、M13、Y3、Y14 和Y15能夠水解淀粉(見(jiàn)表1)。

表1 伽師瓜病原菌的生理生化實(shí)驗(yàn)

3 討論

本研究從貯藏期的伽師瓜病瓜上分離到了13株菌株，通過(guò)16S rRNA全基因序列 和18S rRNA部分基因序列分析，初步確定了可能的病原菌為B2、M1、M11、M12、Y3和Y14。通過(guò)生理生化分析得出：在生長(zhǎng)和儲(chǔ)藏期間，使伽師瓜致病的細(xì)菌為產(chǎn)酸型、且在生活狀態(tài)中，表現(xiàn)出不能產(chǎn)生分解蛋白質(zhì)、淀粉和油脂的胞外酶。另外，伽師瓜致病的主要病源菌是霉菌和酵母菌。這可能和伽師瓜的含糖量高的特性有關(guān)。

通過(guò)本研究的結(jié)果，可以有三點(diǎn)啟示：一是利用這些致病菌的某些特性，象生化特性，如M1和Y14都能夠產(chǎn)生果聚糖，而果聚糖是對(duì)人身體有益的成分，所以，如果能夠變這些致病菌為提高伽師瓜品質(zhì)的有益菌是很有意義的嘗試。二是從分子生物學(xué)角度思考，根據(jù)這些致病菌的基因序列和生化特性，進(jìn)行轉(zhuǎn)基因甜瓜抗病品種的研究，開(kāi)發(fā)伽師瓜體內(nèi)的抗性基因，以對(duì)抗致病菌的生物化學(xué)特性，使其不能存活，從而達(dá)到提高其抗病能力的目的。目前，這方面的研究比較多，諸如對(duì)蔗糖合成酶編碼基因的相關(guān)研究[19， 20]。三是在推動(dòng)本土微生物的基礎(chǔ)研究的基礎(chǔ)上，建立瓜類品種微生物致病菌庫(kù)，給果蔬的微生物學(xué)防治提供平臺(tái)。

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