分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中植物總RNA提取操作初探

趙 胡

(阜陽師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,阜陽 236041)

分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)能加深學(xué)生對(duì)課本理論知識(shí)的理解和運(yùn)用，同時(shí)也是學(xué)生掌握基本技術(shù)，提高科學(xué)思維能力和獨(dú)立操作能力的有效途徑[1]。植物RNA提取的基本技術(shù)廣泛應(yīng)用于科研和生產(chǎn)實(shí)踐中，掌握這一基本技術(shù)是生物學(xué)專業(yè)學(xué)生學(xué)習(xí)后續(xù)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的必備條件，因?yàn)閷W(xué)生提取RNA的質(zhì)量和濃度必需符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求，包括cDNA的反轉(zhuǎn)錄、RT-PCR、cDNA文庫的構(gòu)建等相關(guān)的實(shí)驗(yàn)操作。所以讓學(xué)生學(xué)習(xí)并掌握植物RNA提取的原理技術(shù)和方法是為以后進(jìn)一步學(xué)習(xí)奠定良好的基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)室從2005年起開設(shè)了這一實(shí)驗(yàn)，使學(xué)生對(duì)分子生物學(xué)技術(shù)有了感性認(rèn)識(shí)，提高了學(xué)生學(xué)習(xí)興趣。

植物RNA提取是一項(xiàng)常規(guī)技術(shù)，實(shí)驗(yàn)原理相對(duì)簡(jiǎn)單，但操作流程復(fù)雜。一般認(rèn)為植物RNA提取對(duì)實(shí)驗(yàn)室和實(shí)驗(yàn)器具要求比較苛刻，如果沒有專門的RNA實(shí)驗(yàn)室，本科生實(shí)驗(yàn)課程在大實(shí)驗(yàn)室的有限條件下實(shí)驗(yàn)難以獲得成功，這樣往往大大降低學(xué)生對(duì)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)操作的積極性和熱情[2]。盡管不同文獻(xiàn)報(bào)道關(guān)于RNA方法不盡相同和對(duì)相關(guān)方法的改進(jìn)，但是實(shí)驗(yàn)操作步驟的繁瑣和實(shí)驗(yàn)要求的嚴(yán)格往往限制了學(xué)生課堂實(shí)驗(yàn)教學(xué)的運(yùn)用并使學(xué)生對(duì)開設(shè)這一實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生了畏難心理。為此，我們根據(jù)自身多年的教學(xué)實(shí)踐和對(duì)各院校采用實(shí)驗(yàn)教材的分析，對(duì)“植物RNA提取”實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了改進(jìn)并做了總結(jié)，以供同行商榷。

1 植物RNA提取方法的選擇

目前教科書和文獻(xiàn)報(bào)道上RNA提取方法主要有4種。第一種方法[3]是異硫氰酸胍—酚法(GTC法)，這一方法的原理主要是異硫氰酸胍與β-巰基乙醇共同作用抑制RNase活性，同時(shí)異硫氰酸胍與十二烷基肌酸鈉作用共同使蛋白質(zhì)變性，從而釋放RNA，酸性條件下DNA極少發(fā)生解離并同蛋白質(zhì)一起變性被離心下來，RNA則溶于上清液中。第二種方法[4]是SDS—苯酚法，細(xì)胞內(nèi)大部分RNA均與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起以核蛋白的形式存在。因此，提取RNA時(shí)要把RNA與蛋白質(zhì)分離并除去，將細(xì)胞置于含有十二烷基磺酸鈉的緩沖液中，加等體積的水飽和酚，通過劇烈震蕩，然后離心形成上層水相和下層的酚相。核酸溶于水相被苯酚變性的蛋白質(zhì)或溶于水相或在兩相界面處形成凝膠層。第三種方法[5]是CTAB法，即十六烷基三甲基溴化銨是一種陽離子去污劑，具有從低離子強(qiáng)度溶液中沉淀核酸與酸性多聚糖的特性，在高離子強(qiáng)度溶液中CTAB與蛋白質(zhì)和多聚糖形成復(fù)合物，只是不能沉淀核酸，通過有機(jī)溶劑抽提，去除蛋白多糖酚類等雜質(zhì)后，加入乙醇沉淀即可使核酸分離。第四種方法就是利用takara公司生產(chǎn)的Trizol試劑盒簡(jiǎn)稱Trizol法，Trizol試劑是直接從細(xì)胞或組織中提取總RNA的試劑，它在破碎和溶解細(xì)胞時(shí)能保持RNA的完整性，加入氯仿后離心樣品分成水樣層和有機(jī)層，RNA存在于水樣存中，收集上面的水樣層后，RNA可以通過異丙醇沉淀還原出來。以上這4種方法在植物總RNA提取中均有運(yùn)用，但根據(jù)不同情況選擇相應(yīng)的方法或調(diào)整方法中的成分組分[6]。如多糖含量高時(shí)可選擇CTAB法，蛋白含量高時(shí)可選擇SDS法，多酚含量高時(shí)可添加β-巰基乙醇等還原劑或增加PVP的含量。在講解植物RNA提取原理時(shí)，我們對(duì)這4種方法都逐一介紹，盡管方法不同，但原理都是大同小異的，主要是利用各種烈性試劑破碎細(xì)胞、蛋白變性和DNA沉淀，釋放RNA并溶解在有機(jī)相中而后抽提沉淀RNA。在讓學(xué)生具體操作實(shí)驗(yàn)的過程中，我們僅選擇一種方法，即Trizol法抽提植物組織中的總RNA。這主要是考慮到：1)各種RNA抽提試劑尤其是破碎組織樣品，抑制RNase的烈性試劑對(duì)人體都有一定的毒性和腐蝕性，為了盡量避免因試劑配制帶來的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境污染和安全隱患，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)許可的條件下直接從公司訂購試劑盒提供給學(xué)生做實(shí)驗(yàn)。2)RNA提取實(shí)驗(yàn)的各種試劑繁多，配置起來很繁瑣，而且對(duì)配制溶液的精確度如pH值都有一定的要求，人為的配制溶液可能因?yàn)樵噭┑慕徊嫖廴径_(dá)不到理想的實(shí)驗(yàn)效果。我們可以把更多的時(shí)間和經(jīng)歷用來指導(dǎo)學(xué)生的具體的實(shí)驗(yàn)操作上。另外，為了保證這一實(shí)驗(yàn)的成功，我們對(duì)植物材料的選擇也做了充分的考慮，盡量選擇幼嫩組織如黃化苗，避免次生代謝物含量高的植物組織樣品RNA的提取，研磨樣品切記貪多，一般0.1～0.2 g足以用來抽提RNA。

2 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備和操作過程的簡(jiǎn)易化改進(jìn)

一直以來，同行專家都認(rèn)為植物RNA提取實(shí)驗(yàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)室和實(shí)驗(yàn)器皿的要求很高，如要有專門的RNA提取實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)所用的槍頭、離心管都要用DEPC水浸泡過夜后高溫滅菌烘干備用，實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行，學(xué)生做實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)帶上口罩和一次性的手套并經(jīng)常更換一次性手套，實(shí)驗(yàn)操作過程應(yīng)少說話等等。然而在一個(gè)大實(shí)驗(yàn)室里，讓幾十個(gè)學(xué)生分組實(shí)驗(yàn)同時(shí)做植物RNA提取實(shí)驗(yàn)，要同時(shí)達(dá)到以上這些要求的確有一定的難度，這也是這一實(shí)驗(yàn)在高校分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中一直不夠理想的主要原因。我們對(duì)近幾年植物RNA提取實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了認(rèn)真總結(jié)和思考并結(jié)合文獻(xiàn)中RNA提取操作步驟逐一排查操作誤區(qū)，發(fā)現(xiàn)RNA提取的質(zhì)量與后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求有很大關(guān)系，如構(gòu)建cDNA文庫或做芯片雜交對(duì)RNA要求的質(zhì)量和濃度要求很高，如果是僅做基因的表達(dá)分析或是目的基因的克隆，那么相對(duì)來說RNA質(zhì)量要求就低一點(diǎn)。因此根據(jù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)的目的和要求，我們應(yīng)靈活運(yùn)用RNA提取的原則和注意事項(xiàng)。我們?yōu)閷W(xué)生開設(shè)的這一基礎(chǔ)性實(shí)驗(yàn)，其目的是讓學(xué)生掌握RNA提取的實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)要求，而對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求并不高，只要讓學(xué)生了解RNA提取的嚴(yán)格性和規(guī)范化即可，但在具體的實(shí)驗(yàn)操作上，在不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的情況，結(jié)合學(xué)生實(shí)驗(yàn)的實(shí)際情況應(yīng)有一定的變通。如我們?cè)陬A(yù)實(shí)驗(yàn)中僅把槍頭盒離心管高溫高壓滅菌，事先并沒有用DEPC水處理過夜，研磨樣品的研缽并沒有高溫灼燒，僅是導(dǎo)入少量的酒精燒2～3 min以除去其中的RNase污染。實(shí)驗(yàn)的整個(gè)操作過程并沒有在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行，與平常其它實(shí)驗(yàn)一樣在普通的實(shí)驗(yàn)臺(tái)面上進(jìn)行。但在整個(gè)實(shí)驗(yàn)操作過程中應(yīng)盡量避免說話，操作迅速很重要，尤其是在樣品研磨這一步驟中一定要在低溫液氮下進(jìn)行，粉末狀樣品在液氮環(huán)境下應(yīng)盡量迅速轉(zhuǎn)移到含有強(qiáng)烈抑制RNase活性的Trizol試劑中，這樣保證樣品的RNA始終在RNase無法發(fā)揮作用的環(huán)境下保持完整性不被降解。實(shí)驗(yàn)中間步驟的RNA提取操作都是在有機(jī)溶劑的環(huán)境下進(jìn)行，RNase發(fā)揮作用的機(jī)會(huì)很小。在RNA沉淀的步驟中，這一過程盡量在低溫下操作，沉淀的清洗步驟動(dòng)作迅速，避免長(zhǎng)時(shí)間在空氣中吹干，最后將沉淀的RNA用含有DEPC的水溶解。我們按照這一操作要點(diǎn)，在達(dá)到預(yù)期實(shí)驗(yàn)效果的同時(shí)大大減輕了實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)備工作，實(shí)驗(yàn)結(jié)果電泳如圖1所示。在隨后的正式實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，學(xué)生分組實(shí)驗(yàn)提取RNA均取得了很好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，表明我們對(duì)植物RNA提取實(shí)驗(yàn)的某些環(huán)節(jié)的簡(jiǎn)化是成功的，增強(qiáng)了我們普及這一實(shí)驗(yàn)的信心和積極性。

傳統(tǒng)方法認(rèn)為RNA電泳應(yīng)用甲醛變性的凝膠進(jìn)行，然而我們用普通的TAE緩沖液在不含甲醛的條件下短時(shí)間內(nèi)(15min)電泳總RNA仍然可以清晰的看到三條帶，同時(shí)也避免了甲醛的污染。這一結(jié)果表明盡管RNA抽提的實(shí)驗(yàn)條件要求苛刻，但只要我們操作熟練、注意細(xì)節(jié)和要點(diǎn)、動(dòng)作迅速，短時(shí)間內(nèi)RNA是不會(huì)很快降解的。我們對(duì)這一方法的改進(jìn)收到了良好的教學(xué)效果。

圖1 豌豆幼苗總RNA電泳圖

1—高標(biāo)準(zhǔn)高要求的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境條件下提取豌豆幼苗的總RNA；2、3—普通實(shí)驗(yàn)室條件下簡(jiǎn)易化操作提取豌豆幼苗的總RNA。

3 實(shí)驗(yàn)操作的原則性和靈活性的統(tǒng)一運(yùn)用

在實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，學(xué)生嚴(yán)格按照教科書或指導(dǎo)書上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作對(duì)培養(yǎng)學(xué)生嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目蒲凶黠L(fēng)和科研態(tài)度至關(guān)重要，然而嚴(yán)格實(shí)驗(yàn)操作并不等同于死板教條地按照教科書上的要求去一步一步的完成，那樣的實(shí)驗(yàn)教學(xué)只是機(jī)械地傳授知識(shí)，學(xué)生只能被動(dòng)地接受，學(xué)習(xí)的熱情和積極性受到極大地抑制，達(dá)不到應(yīng)有的教學(xué)效果。實(shí)驗(yàn)教學(xué)的關(guān)鍵是讓學(xué)生理解實(shí)驗(yàn)原理，領(lǐng)會(huì)實(shí)驗(yàn)操作中注意細(xì)節(jié)的原因和道理，掌握實(shí)驗(yàn)操作中關(guān)鍵的技術(shù)環(huán)節(jié)，反復(fù)訓(xùn)練直到學(xué)生能熟能生巧。只有這樣才能達(dá)到我們預(yù)期的實(shí)驗(yàn)效果。針對(duì)為學(xué)生開設(shè)“植物總RNA提取”這一實(shí)驗(yàn)為例，我們應(yīng)該讓學(xué)生明確植物總RNA提取對(duì)實(shí)驗(yàn)條件和實(shí)驗(yàn)室環(huán)境要求很高，其主要原因就是我們周圍環(huán)境中大量存在RNase，RNA又易被RNase降解，這樣會(huì)導(dǎo)致我們實(shí)驗(yàn)的失敗。但是這樣講授往往會(huì)讓學(xué)生產(chǎn)生畏難心理，擔(dān)心實(shí)驗(yàn)不能成功，做起實(shí)驗(yàn)放不開，手忙腳亂，反而會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果不理想。我們隨即把話鋒一轉(zhuǎn)，告訴學(xué)生任何酶發(fā)揮作用都需要一定的環(huán)境和一定的時(shí)間，如果我們能提供一個(gè)提取RNA的無RNase的微環(huán)境，并且我們的操作迅速，同樣也能提取出一個(gè)效果很好的總RNA，這樣才能提高學(xué)生對(duì)做好這一實(shí)驗(yàn)的信心，有利于培養(yǎng)學(xué)生的興趣。

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