深海產(chǎn)低溫脂肪酶菌株Dspro004的誘變育種

楊 帆,李福英,何雄飛,曾潤穎,產(chǎn)竹華

(國家海洋局海洋生物遺傳資源重點實驗室 國家海洋局第三海洋研究所，廈門 361005)

脂肪酶(Lipase,EC 3.1.1.3)也叫三酰甘油脂水解酶，是一類重要的酯鍵水解酶，能夠在油-水界面上催化天然油脂(甘油三脂)生成游離的脂肪酸、甘油和甘油單酯或甘油二酯，廣泛存在于動物、植物和微生物中[1-3]?，F(xiàn)代工業(yè)中脂肪酶經(jīng)常被應(yīng)用于油脂水解[4]、食品加工[5]、食品品質(zhì)改良[6,7]、疾病診斷[8]、催化藥物合成[9-11]、皮革生產(chǎn)、可生物降解的無污染洗滌劑的研發(fā)[12]和生物柴油的生產(chǎn)等方面[13， 14]。在諸多來源的脂肪酶中，微生物脂肪酶是工業(yè)用脂肪酶的重要來源，是生物技術(shù)和有機化學(xué)應(yīng)用中使用最為廣泛的酶類之一。其原因在于微生物種類多、繁殖快，易發(fā)生遺傳變異，產(chǎn)生的脂肪酶具有比動植物脂肪酶作用更廣的 pH 值、反應(yīng)溫度范圍以及底物專一性；而且微生物來源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，適合于工業(yè)化大生產(chǎn)和樣品提純[15]。隨著工業(yè)的發(fā)展與人類需求的不斷擴大，得到一株高產(chǎn)、性質(zhì)特殊的產(chǎn)脂肪酶菌株越來越成為脂肪酶應(yīng)用研究開發(fā)的關(guān)鍵。在加緊尋找自然界中的優(yōu)秀產(chǎn)酶菌株之外，誘變育種也是獲得高產(chǎn)菌株的有效手段。

誘變育種是使用物理或化學(xué)誘變劑處理菌株，促進其突變率大幅提高，然后采用簡便、快速和高效的篩選方法，從中挑選少數(shù)符合育種目的的突變株，達到提高代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量、改進產(chǎn)品質(zhì)量、擴大品種和簡化生產(chǎn)工藝的目的[16-18]。本文從一株深海產(chǎn)低溫脂肪酶的菌株Dspro004出發(fā)，通過紫外誘變得到了高產(chǎn)菌株，并進行了該突變菌株的遺傳穩(wěn)定性的測試，為該菌株今后的工業(yè)生產(chǎn)奠定了良好的實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株

本文實驗采用的野生菌株Dspro004分離自東太平洋(107°38′ 23″ W，13°19′ 40″ N)水深4950 m的深海沉積物，采用脂肪酶篩選培養(yǎng)基篩選獲得并保存于本實驗室。

1.2 培養(yǎng)基

1)LB培養(yǎng)基：Yeast Extract 0.5%，Tryptone 1%，NaCl 1%。

2)脂肪酶篩選培養(yǎng)基：豬油1%，Yeast Extract 0.5%，瓊脂1.5%，由原位海水配制。

三丁酸甘油酯篩選培養(yǎng)基：三丁酸甘油酯1%，Yeast Extract 0.5%，瓊脂1.5%，由原位海水配制。

1.3 紫外誘變初篩

1.3.1 誘變劑量的確定

將Dspro004菌種接種至液體LB培養(yǎng)基中，繪制生長曲線并確定其對數(shù)期。取對數(shù)生長期的菌液，經(jīng)5000 r/min離心5 min，棄去上清液。用滅菌的生理鹽水(0.85% NaCl)溶液洗滌菌體兩次以除去培養(yǎng)基成分，繼續(xù)用生理鹽水調(diào)節(jié)菌液OD600至0.6～0.7，取5 mL稀釋后的菌液至直徑60 mm的無菌培養(yǎng)皿中進行紫外照射誘變。紫外照射條件為：輸出功率2×6 W，距離30 cm。紫外燈預(yù)熱20 min后，放入菌液，在黑暗條件下進行紫外照射，同時進行磁力攪拌。照射不同時間后，立刻取出500 μL菌液在20℃下避光孵育30 min。在紅光環(huán)境中，用生理鹽水進行梯度稀釋，取10-4，10-5兩個稀釋度的菌液各100 μL，均勻涂布LB平板，每個梯度設(shè)置3個平行樣。按相同方法對未經(jīng)照射的出發(fā)菌株進行孵育和稀釋涂布，以作為對照平板。涂布完畢后將平板放置在20℃下避光培養(yǎng)1～4 d，待菌落長出后計數(shù)菌落，統(tǒng)計致死率[19]。

1.3.2 誘變篩選

在誘變預(yù)實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，選擇合適的致死率所對應(yīng)的誘變時間，進行紫外照射。之后避光孵育30 min，并用滅菌生理鹽水進行梯度稀釋，取10-5稀釋度的菌液100 μL在三丁酸甘油酯篩選平板上進行均勻涂布。置于15℃下避光培養(yǎng)3～5 d，根據(jù)透明圈大小篩選突變菌株。

1.4 紫外誘變復(fù)篩與遺傳穩(wěn)定性測試

挑選透明圈較大的菌落用液體LB培養(yǎng)基在15℃、200 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)48 h，取發(fā)酵液上清，利用pNPP法測定脂肪酶活力。將復(fù)篩平板上的高活力突變菌株與出發(fā)菌株一起，進行連續(xù)傳代培養(yǎng)，每一代進行保種并測定酶活。其中每個菌株均設(shè)3個平行樣，取平均值作為結(jié)果。各代均以出發(fā)菌株作為對照，以確定突變菌株的高產(chǎn)能力是否穩(wěn)定遺傳。

1.5 pNPP法測定脂肪酶活力[20]

脂肪酶作用于底物(p-NPP) 后會產(chǎn)生黃色的對硝基酚p-Nitrophenol(p-NP)，該產(chǎn)物在405nm處具有光吸收值。通過該光譜法可以檢測培養(yǎng)基中脂肪酶的活力。脂肪酶活單位U定義為：1 min酶解底物釋放出1 μmol的p-Nitrophenol所需的酶量為一個酶活單位。

配制終濃度為100 μmol/L的p-Nitrophenyl palnitate溶液，配制時先用5 mL的異丙醇溶解pNPP粉末，再用0.05 mol/L，pH9.0的Tris-HCl定容至100 mL。向2955 μL底物溶液中加入15μL(0.1 μg/μL)脂肪酶液，在25℃下反應(yīng)10 min后加入30μL的NaOH(5 mol/L)溶液終止反應(yīng)，測定OD405值。

2 實驗結(jié)果

2.1 Dspro004野生菌的紫外誘變初篩

通過對野生菌株不同時間的紫外誘變菌液的涂板計數(shù)，得到對應(yīng)誘變時間的致死率結(jié)果(圖1)。致死率在70%～80%之間時，產(chǎn)生正突變的幾率較高，更有利于進一步篩選[21]。涂板計數(shù)結(jié)果表明：當(dāng)功率為12W，照射距離為30 cm，照射時間為20 min時，致死率達到81.3%，因此選定20 min為最佳照射時間。稀釋度為10-4時可以看清菌落，但是透明圈分辨起來困難，故而稀釋度為10-5時效果最佳。

圖1 Dspro004菌株紫外誘變效果

將紫外照射后的菌液在三丁酸甘油篩選平板上均勻涂布，20℃下培養(yǎng)3 d出現(xiàn)透明圈。統(tǒng)計菌落數(shù)，與出發(fā)菌株相比，致死率約為79.1%，符合正向突變有利篩選條件。以出發(fā)菌株為對照，挑選出90株透明圈/直徑比(HE)值均大于對照的變異菌株，依次編號為UM1～UM90。

2.2 Dspro004高產(chǎn)脂肪酶突變菌株復(fù)篩與遺傳穩(wěn)定性

從上述平板中挑選誘變后HE值較大的菌落UM3、UM5、UM14、UM16、UM32、UM49、UM55在液體LB培養(yǎng)基中進行15℃、48 h的搖培，并取發(fā)酵液測定脂肪酶活力。結(jié)果表明(圖2)，相對于出發(fā)菌株，菌株UM3活力可達到2560 U/mg，相對出發(fā)菌株提高33.9%，活力提高最明顯。

選取菌株UM3進行遺傳穩(wěn)定性試驗，與出發(fā)菌株同時進行了20代傳代培養(yǎng)和酶活測定(表1)。各代菌體發(fā)酵液的平均酶活力相對出發(fā)菌株酶活保持在134%～139%之間，酶活力保持在2540～2710 U/mg，并且同代無顯著差異，表明該菌株的產(chǎn)酶具有較好的遺傳穩(wěn)定性。

圖2 Dspro004突變菌株復(fù)篩結(jié)果

表1 UM3突變株的遺傳穩(wěn)定性實驗

2.3 菌株UM3脂肪酶酶學(xué)性質(zhì)分析

2.3.1 溫度對酶活性的影響

分別測定菌株UM3脂肪酶在不同溫度下(5℃～70℃)水解底物的活力，以研究其最適作用溫度。結(jié)果表明，酶在20℃～30℃范圍具有較高的酶活力，酶的最適反應(yīng)溫度為30℃(圖3)，表現(xiàn)出明顯的冷適應(yīng)特征，因此該酶可確定為低溫脂肪酶，后續(xù)實驗脂肪酶活力測定均在30℃下進行。

圖3 溫度對脂肪酶活力的影響

2.3.2 pH值對酶活性的影響

用磷酸氫鈉-檸檬酸鈉(pH值4～8)、Tris-HCl(pH值7～8)、NaHCO3-Na2CO3(pH值8～10)、Na2HPO4-NaOH(pH值11)緩沖液配制pNPP底物溶液，測定不同pH值下脂肪酶的酶活力。實驗表明(圖4)，酶在pH值7.5～9.5的范圍具有較高的酶活力，酶的最適反應(yīng)pH值為8.5，表明該酶為堿性脂肪酶。

圖4 pH值對脂肪酶活力的影響

2.3.3 酶的熱穩(wěn)定性

將酶液放置不同溫度下保溫一定時間后取出酶液，測定殘余脂肪酶的活力，在最適溫度下反應(yīng)。實驗結(jié)果表明(圖5)，該脂肪酶在20℃～30℃具有良好的熱穩(wěn)定性，20℃保持12 h后仍具有80%以上的活力，30℃下保持12 h后酶活力仍有70%。40℃保溫2 h活力剩余72%，4 h僅余6%。50℃以上0.2 h基本喪失酶活。

圖5 溫度對脂肪酶穩(wěn)定性的影響

2.3.4 酶液對pH值的耐受性

圖6 pH值對脂肪酶穩(wěn)定性的影響

分別將酶液加入pH值6～9的磷酸鹽緩沖液冰浴中保存一定時間后，將酶液在最適反應(yīng)溫度下測定殘余酶活力。結(jié)果表明，在pH值8條件下保持12 h后殘余酶活力仍有80%，在pH值7條件下保持12 h后殘余酶活力為75%，在pH值6和pH值9條件下穩(wěn)定性較差，保持12 h后分別剩余51%和46%(圖6)。

3 結(jié)論

與傳統(tǒng)的誘變育種相比，建立在現(xiàn)代基因操作技術(shù)基礎(chǔ)上的基因改造更為精確，但誘變育種往往能帶來更為復(fù)雜的連鎖反應(yīng)結(jié)果，且更簡便易行、快速、收效大，因而在實際工業(yè)應(yīng)用中被更多地采用。紫外誘變安全簡便，對環(huán)境毒害作用小，不易回復(fù)突變，因此本文采用紫外照射作為誘變劑篩選脂肪酶高產(chǎn)菌株。選擇致死率為81%的誘變劑量，獲得了酶活力最高達到2710 U/mg的突變株，產(chǎn)酶活力比出發(fā)菌株提高了約39%。雖然這與工業(yè)生產(chǎn)菌株的4000～6000U/mg[22]還有一定差距，希望通過進一步的發(fā)酵條件的優(yōu)化和代謝的調(diào)控來提高脂肪酶產(chǎn)量。

對于生產(chǎn)菌株來說，必須要具備穩(wěn)定的遺傳性狀才能在工業(yè)生產(chǎn)上廣泛應(yīng)用。本文所篩選到的菌株UM3突變株連續(xù)20代繼代培養(yǎng)結(jié)果表明，該突變株的遺傳性狀穩(wěn)定，為未來該菌株的實際工程應(yīng)用奠定了良好的實驗基礎(chǔ)。

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