CdSe量子點的合成及其標(biāo)記水楊酸受體研究

蘇燁華，俞 英

(華南師范大學(xué)化學(xué)與環(huán)境學(xué)院，廣東廣州510006)

水楊酸是一種重要的內(nèi)源信號分子，能夠激活植物過敏反應(yīng)和系統(tǒng)抗性，影響植物生長發(fā)育［1］.水楊酸的細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)首先要與細胞表面的特異受體結(jié)合，確認和標(biāo)記受體對研究水楊酸的作用機制非常重要.目前研究激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)常用的方法是放射性標(biāo)記法或用傳統(tǒng)熒光染料標(biāo)記法，但放射性標(biāo)記存在放射性污染，傳統(tǒng)的熒光試劑存在光漂白現(xiàn)象等缺點.量子點是一種良好的半導(dǎo)體發(fā)光材料，其直徑一般介于2～8 nm 之間，有寬且連續(xù)分布的激發(fā)光譜和窄且對稱分布的發(fā)射光譜，光學(xué)特性優(yōu)異，且光化學(xué)穩(wěn)定性好［2－4］. 目前量子點應(yīng)用于植物細胞研究領(lǐng)域的報導(dǎo)較少，這可能是植物細胞的細胞壁阻擋以及細胞膜的選擇透過性所導(dǎo)致［5］.

雙修飾量子點相對于單修飾量子點，具有穩(wěn)定性更高，熒光性能更好的優(yōu)勢. 劉婧文等［6］分別以D、L－青霉胺和L－半胱氨酸作為組合修飾劑合成CdSe 納米晶，發(fā)現(xiàn)雙修飾劑修飾的納米晶比單修飾劑修飾的納米晶熒光強度高，穩(wěn)定性好，并成功以CdSe 納米晶作為熒光探針對大腸桿菌進行標(biāo)記.鄭愛芳等［7］在水相中以巰基乙酸和半胱氨酸為混合修飾劑合成了光譜可調(diào)的CdTe 納米棒，該納米棒被用作銅離子熒光探針. 陳幗敏等［8］用D－青霉胺和L－半胱氨酸雙修飾CdSe 納米晶，并進一步建立了測定痕量Hg(II)的方法.田建裊等［9］合成了以巰基乙酸和谷胱甘肽共同修飾CdTe 量子點，其量子產(chǎn)率63%，并成功將其應(yīng)用于標(biāo)記鼠纖維肉瘤細胞. 另 外，楊 衛(wèi) 海［10］、YAN［11－12］、MOLONEY［13］、LI［14］等也分別合成不同雙修飾的量子點并對其結(jié)果進行了一些探討.

本文以MPA 和MSA 為修飾劑，合成了雙修飾劑修飾的CdSe 量子點，提高量子點的水溶性和穩(wěn)定性，應(yīng)用于綠豆幼苗中標(biāo)記水楊酸受體位點，有助于闡明受體的分布，為進一步分離純化受體蛋白提供必要的理論依據(jù).

1 實驗部分

1.1 藥品和儀器

F－2500 型熒光光譜儀(日本日立公司);UV－Vis 1700 型紫外－可見分光光度計(上海天美科學(xué)儀器公司);JEM－2100HR 型透射電子顯微鏡(日本電子公司);熒光顯微鏡(Nikon Eclipse 50i，日本尼康);TG16－W 微量高速離心機(廣州廣一科學(xué)儀器公司);pHS－3C 型酸度計(上海雷磁儀器廠).

對氨基水楊酸(98%，上海晶純實業(yè)有限公司);NaBH4(96.0%，上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司);硒粉(99.99%，Strem Chemicals);CdCl2·2.5H2O(分析純，≥99.0%，廣州化學(xué)試劑廠);巰基丙酸(簡稱MPA，Aldrich 公司);NaOH、甲醇均為分析純.

1.2 實驗方法

1.2.1 對巰基水楊酸和3－巰基丙酸雙修飾CdSe量子點( CdSe/MPA/MSA) 的合成 參照文獻［15］，以對氨基水楊酸為原料合成出對巰基水楊酸. 參考文獻［16］合成巰基丙酸修飾的CdSe 的方法，稱取0.25 mmol(0.019 7 g)硒粉和0.5 mmol (0.020 0 g)NaBH4放入反應(yīng)瓶，加入1 mL 二次水，蓋上瓶塞，冰箱中反應(yīng)1 h，得到無色透明的NaHSe 溶液;三口燒瓶中加入50 mL 二次水，通氮氣10 min，取0.02 mmol(0.004 7 g)CdCl2·2. 5H2O 加入溶解，加入0.05 mmol(4.35 μL)巰基丙酸，用1 mol/L 的NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH 值至11.30，通氮30 min;取0.01 mmol(40 μL)新制的NaHSe 溶液加入至CdCl2·2.5H2O 溶液中，在100 ℃下恒溫水浴回流30 min，得到Cd∶Se∶MPA =1 ∶0.5 ∶2.5 的 黃 綠 色CdSe 量 子 點(CdSe/MPA)，以Se 計算，CSe=2.0 ×10－4mol/L.

在CdSe/MPA 的基礎(chǔ)上，按MPA∶MSA 摩爾比為2.5∶1 的比例加入0.02 mmol(0.003 4 g)MSA，用NaOH 溶液調(diào)整溶液pH 至11.30，在90 ℃下加熱回流45 min，得到MPA 和MSA 共同修飾的CdSe 量子點(CdSe/MPA/MSA). 在本實驗條件下，得到的雙修飾量子點的顏色與CdSe/MPA 基本相同.

1.2.2 CdSe/MPA/MSA 對綠豆的毒性分析 取100 顆綠豆種子放入培養(yǎng)皿中，分別加入二次水、MSA、CdSe/MPA、CdSe/MPA/MSA 4 種 溶 液，在27 ℃下恒溫培養(yǎng).培養(yǎng)30 h 后觀察并計算發(fā)芽率，4 d 后觀察綠豆幼苗的生長情況，確定成活率.在此期間要保證綠豆幼苗根部有培養(yǎng)液浸泡.

1.2.3 CdSe/MPA/MSA 標(biāo)記綠豆幼苗水楊酸受體取綠豆幼苗的根、莖或子葉部位，徒手切片，放入離心管，分別加入二次水、MSA、CdSe/MPA、CdSe/MPA/MSA 等溶液，35 ℃條件下振蕩培養(yǎng)4 h.

取出樣品，除去培養(yǎng)液，加入二次水，以1 000 r/min 離心1 min 并重復(fù)3 次，將樣品洗滌干凈. 將處理完的樣品轉(zhuǎn)移至載玻片上，蓋上蓋玻片，注意保持樣品處于濕潤狀態(tài). 在熒光顯微鏡下以藍光作為激發(fā)光源，放大100 倍進行觀察拍照.

2 結(jié)果與討論

2.1 CdSe/MPA/MSA 的制備條件優(yōu)化

采用單因素法對雙修飾量子點的合成條件進行優(yōu)化，主要考察了pH、修飾劑的摩爾比、回流時間、回流溫度等對量子點熒光強度的影響.

由圖1A 看出當(dāng)MPA∶MSA =2.5 ∶1 時，CdSe/MPA/MSA 的熒光最強，因為在這個配比條件下，量子點的表面缺陷相對較少;當(dāng)MSA 所占比例小于1時，量子點的表面缺陷較多，因而CdSe/MPA/MSA的熒光強度較弱;而當(dāng)MSA 所占比例大于1 時，CdSe/MPA/MSA 溶液中質(zhì)點增多，導(dǎo)致量子點產(chǎn)生熒光自猝滅現(xiàn)象，所以熒光強度降低.

不同pH 對CdSe/MPA/MSA 量子點的熒光強度的影響如圖1B. 合成CdSe/MPA/MSA 時，在pH為11.30 時為最佳酸度，此時其熒光強度達最大值.

不同的回流時間對CdSe/MPA/MSA 熒光強度的影響見圖1C，回流45 min 以后，熒光強度隨回流時間的延長而下降.因此，45 min 是回流最佳時間.

考察40～100 ℃范圍內(nèi)回流溫度對CdSe/MPA/MSA 熒光強度的影響，隨著溫度的逐漸上升(圖1D)，CdSe/MPA/MSA 的熒光強度有逐漸增強的趨勢，并在90 ℃時，熒光強度達到最強. 因此以90 ℃作為合成CdSe/MPA/MSA 的回流溫度.

2.2 CdSe/MPA/MSA 的表征

2.2.1 CdSe/MPA/MSA 的透射電鏡觀察 圖2 中黑點為CdSe/MPA/MSA 量子點，尺寸分布較為均一，形狀大致呈球形，粒徑約為3～4 nm. 說明雙修飾量子點仍保持了粒徑小，分散均勻的特點.

2.2.2 CdSe/MPA/MSA 的紫外及熒光光譜表征分別把CdSe/MPA/MSA、CdSe/MPA 以及MSA 的紫外光譜作了對比(圖3A)，發(fā)現(xiàn)CdSe/MPA/MSA 和CdSe/MPA 在400 nm 左右都有1個寬的吸收峰，且CdSe/MPA/MSA 的吸收峰相對CdSe/MPA 有一定的紅移，幅度約為4 nm，說明對巰基水楊酸與CdSe/MPA 確實發(fā)生了作用.紫外紅移可能是由于電子離域使CdSe/MPA/MSA 量子點的限域能降低，導(dǎo)致其激發(fā)態(tài)能量比CdSe/MPA 有所降低［17］.

圖1 不同條件對CdSe/MPA/MSA 熒光強度的影響Figure 1 Effect of different conditions on fluorescence intensity of CdSe/MPA/MSA

圖2 CdSe/MPA/MSA 透射電鏡圖Figure 2 TEM photograph of CdSe/MPA/MSA

圖3B 表明，相對于對巰基水楊酸本身熒光光譜λex/λem=303 nm/402 nm，CdSe/MPA 和CdSe/MPA/MSA 量子點的激發(fā)光譜都很寬，2 種量子點發(fā)射峰的位置都在540 nm 附近. 說明MSA 的熒光光譜并不會影響到水楊酸受體探針熒光光譜的檢測.CdSe/MPA/MSA 熒光強度比CdSe/MPA 有明顯增強，可能是MSA 作為第二修飾劑與CdSe 結(jié)合后，減少了CdSe 表面缺陷的緣故. 相對于CdSe/MPA，CdSe/MPA/MSA 的激發(fā)峰的第一個峰位置藍移了大約25 nm，而后面的2個峰位置基本不變但強度明顯上升，激發(fā)峰的寬度明顯增加且強度上升，證明MSA 確實與CdSe/MPA 發(fā)生了作用.從圖中也表明雙修飾量子點保持了量子點的熒光光譜的特征.

2.3 CdSe/MPA/MSA 對綠豆幼苗標(biāo)記

2.3.1 CdSe/MPA/MSA 對綠豆幼苗的毒性分析通過統(tǒng)計綠豆的發(fā)芽率和幼苗成活率來確定CdSe/MPA/MSA 毒性(表1). 在30 h 內(nèi)在各種培養(yǎng)液綠豆的發(fā)芽率較高，說明在一定的誤差范圍內(nèi)，各種培養(yǎng)液不會影響綠豆的發(fā)芽過程.

根據(jù)綠豆幼苗的根部形態(tài)統(tǒng)計成活率，若其根部枯萎，或者根部很細短且變黑則可確定幼苗已經(jīng)死亡. 由表1 統(tǒng)計的成活率來看，MSA 溶液與二次水培養(yǎng)的綠豆幼苗成活率相同;而用量子點培養(yǎng)的樣品其成活率相對二次水已大大降低，說明量子點對綠豆幼苗的毒性已經(jīng)顯現(xiàn)，并影響了綠豆幼苗的生長.量子點的毒性都是隨著濃度的降低逐漸減小，特別是5 ×10－5mol/L 的量子點，無論是單修飾還是雙修飾，用其培養(yǎng)的樣品成活率與二次水相比相差不大;相對于單修飾量子點，雙修飾量子點對綠豆幼苗的毒性稍有下降.

圖3 CdSe/MPA/MSA 的紫外吸收光譜和熒光光譜Figure 3 The UV absortion spectrum and Fluorescence spectrum of CdSe/MPA/MSA

表1 CdSe/MPA/MSA 對綠豆的毒性分析Table 1 Toxicity of CdSe/MPA/MSA in mung bean

2.3.2 CdSe/MPA/MSA 標(biāo)記綠豆幼苗水楊酸受體

水楊酸可以與綠豆幼苗中的水楊酸受體特異性結(jié)合，而CdSe 量子點可以測量的熒光信號，確定受體位點.

(1)CdSe/MPA/MSA 標(biāo)記綠豆幼苗根部組織.CdSe/MPA 培養(yǎng)的樣品相對于空白樣品，未見明顯熒光增強現(xiàn)象(圖4);MSA 培養(yǎng)的樣品，其組織外圍相比空白樣品有微弱的熒光增強，但是幅度不大;而CdSe/MPA/MSA 培養(yǎng)的樣品，可觀察到明顯的熒光增強效應(yīng)，其內(nèi)皮層組織熒光現(xiàn)象比較明顯，說明其中的水楊酸受體較密集;此時皮層薄壁組織清晰可見，可能分布水楊酸受體，但其聚集程度相對較低.CdSe/MPA/MSA 使綠豆幼苗根部組織熒光明顯增強的原因是CdSe/MPA/MSA 中的MSA 能與綠豆幼苗根部的水楊酸受體結(jié)合，因此CdSe/MPA/MSA能不被洗脫而穩(wěn)定存在于根部組織中.

圖4 CdSe/MPA/MSA 標(biāo)記綠豆幼苗根部Figure 4 CdSe/MPA/MSA labeled root of mung bean

(2)CdSe/MPA/MSA 標(biāo)記綠豆幼苗莖部組織.CdSe/MPA 培養(yǎng)的樣品相對空白樣品未見明顯的熒光增強現(xiàn)象(圖5);MSA 溶液培養(yǎng)的樣品外圍有微弱熒光增強現(xiàn)象，但不能與本體熒光區(qū)別;而CdSe/MPA/MSA 培養(yǎng)的樣品相對空白樣品，可見其邊界和內(nèi)皮層組織都有一定的熒光增強現(xiàn)象，雖微弱，但其皮層薄壁組織也依稀可見. 說明綠豆幼苗莖部也可能存在水楊酸受體，但是相對于根部，其量極微小.

圖5 CdSe/MPA/MSA 標(biāo)記綠豆幼苗莖部Figure 5 CdSe/MPA/MSA labeled stalk of mung bean

(3)CdSe/MPA/MSA 標(biāo)記綠豆幼苗子葉組織.空白樣品顯示紅光，若樣品中帶紅光，并不能作為水楊酸與受體結(jié)合的表現(xiàn)(圖6). CdSe/MPA 和MSA溶液培養(yǎng)的樣品都帶有紅光，這很可能是由于子葉的本底熒光所致;而CdSe/MPA/MSA 培養(yǎng)的樣品，有明顯的熒光增強效應(yīng)，其熒光相比本底顏色有較大差別，較明亮.表明可能有水楊酸受體存在于子葉中.

圖6 CdSe/MPA/MSA 標(biāo)記綠豆幼苗子葉Figure 6 CdSe/MPA/MSA labeled cotyledon of mung bean seedlings

綜上所述，綠豆幼苗的水楊酸受體主要存在于根部，莖部含量較少，子葉有水楊酸受體存在. 水楊酸受體主要分布于內(nèi)皮層組織. CdSe/MPA 因為沒有與受體結(jié)合的激素分子，通過洗滌離心后則不能存在于綠豆幼苗組織內(nèi);而MSA 雖然可以與受體結(jié)合，但在以藍光作激發(fā)的條件下，其不能產(chǎn)生熒光;而CdSe/MPA/MSA 因為有水楊酸分子，同時也具有量子點的光學(xué)特性，因此可以利用其標(biāo)記綠豆幼苗水楊酸受體.

3 展望

通過雙修飾的方法合成了水楊酸受體探針，對探針的合成條件進行優(yōu)化和表征，并利用量子點優(yōu)良的光學(xué)性能簡便地標(biāo)記出綠豆幼苗中的水楊酸受體位點.目前量子點應(yīng)用于植物的研究還處于初級階段，其技術(shù)有待發(fā)展和完善，如何合成出在長波段發(fā)射熒光的量子點從而使背景干擾的影響降到最低，以及無毒副作用地使有特異識別功能的量子點進入植物細胞，甚至定量測定植物中相應(yīng)的受體，都值得進一步的研究.

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