16SrDNA序列技術(shù)分析鑒定顆粒污泥中的微生物

宋文哲，陳 竹，陳元彩 ，胡勇有

(1.華南理工大學(xué)制漿造紙國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510640;2.華南理工大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州510006)

五氯酚(PCP)是具有致畸、致癌、致突變作用的難生物降解的異型生物質(zhì)，作為殺菌劑、防腐劑大量使用，在皮革、紡織、造紙等廢水中廣泛存在.微好氧顆粒污泥技術(shù)將厭氧和好氧在時(shí)間和空間上結(jié)合起來，使好氧氧化和厭氧還原同時(shí)發(fā)生，既節(jié)省空間，又可以縮短操作周期，是一種新型的廢水處理技術(shù)［1］.

顆粒污泥內(nèi)部的微生物生態(tài)特征和顆粒污泥對水污染物的處理效率直接相關(guān)，全面了解降解五氯酚的微好氧顆粒污泥中微生物種類、數(shù)量及其動(dòng)態(tài)性，認(rèn)識(shí)細(xì)菌群落的穩(wěn)定性和功能性等特征具有重要作用［2－3］.傳統(tǒng)的微生物法用于環(huán)境生物學(xué)研究時(shí)環(huán)境中只有不超過10%的微生物可以培養(yǎng)［4］.16S rDNA 為細(xì)胞所共有;其功能同源且最為古老;既含有保守序列又含可變序列;分子大小適合操作;它的序列變化與進(jìn)化距離相適應(yīng)［5］，16S rRNA 序列分析作為微生物分類系統(tǒng)的主要依據(jù)也得到了廣泛認(rèn)同［6－9］.

16S rDNA 技術(shù)應(yīng)用于PCP 的研究在國內(nèi)外已多見報(bào)道，TARTAKOVSKY 等［10］通過16S rDNA 技術(shù)分析和鑒定了2 種降解PCP 的菌;曾光明等［11］通過16S rDNA 分析微生物群落組成的變化評(píng)價(jià)和預(yù)測堆肥成熟和PCP 污染的指標(biāo);李向麗等［12］應(yīng)用16S rRNA 基因克隆文庫方法對PCP 厭氧生物降解體系中細(xì)菌群落的組成和相對豐度進(jìn)行了研究，進(jìn)一步拓寬了對PCP 降解微生物多樣性的認(rèn)識(shí).然而通過比較DEEG 條帶強(qiáng)度的相對變化從而定量研究PCP 對污泥中細(xì)菌群落動(dòng)態(tài)變化未見報(bào)道，本研究通過定量分析污泥中各種菌的相對數(shù)量變化，為解析微氧顆粒污泥的微生物群落結(jié)構(gòu)與群落動(dòng)態(tài)，從而發(fā)現(xiàn)降解PCP 的優(yōu)勢菌群，為進(jìn)一步探索微氧顆粒污泥中微生物降解五氯酚的機(jī)理提供依據(jù).

1 材料和方法

1.1 污泥樣品的采集

污泥樣品培養(yǎng)參考文獻(xiàn)［2］，分別取自微好氧顆粒污泥反應(yīng)器，包括接種污泥、微好氧顆粒污泥以及用PCP 馴化后的成熟顆粒污泥.其中微好氧顆粒污泥取自溶解氧低于0.6 mg/L 的情況下在微好氧顆粒污泥發(fā)生器中培養(yǎng)60 d 的污泥，PCP 馴化的成熟顆粒污泥取自用PCP 從0.2 mg/L 增加到6 mg/L的廢水對微好氧顆粒污泥馴化培養(yǎng)120 d 的污泥.每次取樣約500 mg，于5 000 r/min 離心5 min 后棄去上清液備用.

1.2 顆粒污泥總DNA 的提取及PCR 擴(kuò)增

顆粒污泥總DNA 提取參考文獻(xiàn)［2］，真細(xì)菌PCR 擴(kuò)增對象為真細(xì)菌16S rDNA V3 可變區(qū)，其引物為:上游引物為:5’－ CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GCC TAC GGG AGG CAG CAG－3’;下游引物為:5’－ ATT ACC GCG GCT GCT GG－3’.古細(xì)菌PCR 擴(kuò)增對象為古細(xì)菌16S rDNA V3 可變區(qū)，其引物為:上游引物為:5’－ CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GTC CAG GCC CTA CGG GG－3’;下游引物為:5’－ TTA CCG CGG CTG CTG GCA C－3’.PCR 的反應(yīng)程序:94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性0.5 min，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸0.5 min，30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min.PCR 反應(yīng)體系中基因組0.5 μL，10 × Buffer(含2.0 mmol/L MgCl2)5.0 μL，dNTP(10 mmol/L)1.0 μL，上游引物(10 μmol/L)1.0 μL，下游引物(10 μmol/L)1.0 μL，Taq 酶(5 U/μL)0.25 μL，ddH2O41.25 μL.

1.3 變性梯度凝膠電泳及測序構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹

變性梯度凝膠電泳及測序構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹參考文獻(xiàn)［2］，擴(kuò)增過程中真細(xì)菌的引物為:上游引物:5’－ACT CCT ACG GGA GGC AGC AG－3’;下游引物:5’－ATT ACC GCG GCT GCT GG－3’. 古細(xì)菌的引物為:上游引物:5’－ TC CAG GCC CTA CGG GG－3’;下游引物:5’－ TTA CCG CGG CTG CTG GCA C－3’.

2 結(jié)果與討論

2.1 顆粒污泥中細(xì)菌種群比對及其系統(tǒng)進(jìn)化樹

將3 種顆粒污泥樣品中真細(xì)菌和古細(xì)菌DGGE圖譜的主要條帶進(jìn)行切膠回收并測序，分別得到6個(gè)和5個(gè)可用序列進(jìn)行序列同源性分析. 采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹. 對進(jìn)化樹樹形的穩(wěn)定性進(jìn)行檢測，輸出60%以上的數(shù)值(圖1、圖2).

圖1 真細(xì)菌進(jìn)化樹的BOOTSTRAP 檢測值Figure 1 BOOTSTRAP check of phylogenetic tree of Eubacteria

從真細(xì)菌進(jìn)化樹可以看出，6個(gè)測序的條帶主要可分為4 大類群:Band 4、19、25 之間的同源性較高，可歸為GroupⅠ;Band 16 可歸為GroupⅡ;Band 17 可歸為GroupⅢ;Band 37 可歸為GroupⅣ.

圖2 古細(xì)菌進(jìn)化樹的BOOTSTRAP 檢測值Figure 2 BOOTSTRAP check of phylogenetic tree of Archaea

從測序的條帶進(jìn)化樹看出，古細(xì)菌可分為3 大類群:Band 26、27、28 之間的同源性較高，可歸為GroupⅠ.Band 9 可歸為GroupⅡ;Band 21 可歸為GroupⅢ.

2.2 顆粒污泥微生物分析

DGGE 條帶的強(qiáng)弱反映了相對的數(shù)量，通過BandScan 軟件對3 種不同顆粒污泥中的真細(xì)菌和古細(xì)菌DGGE 圖像進(jìn)行分析，得到真細(xì)菌和古細(xì)菌主要條帶的強(qiáng)度圖(圖3、圖4).

利用Shannon 多樣性指數(shù)計(jì)算公式得出真細(xì)菌的在接種污泥、微好氧顆粒污泥、PCP 馴化的微好氧顆粒污泥的指數(shù)分別為2.09、2.61、2.55，結(jié)合真細(xì)菌DGGE 條帶強(qiáng)度圖發(fā)現(xiàn)接種污泥在微好氧條件下出現(xiàn)新的條帶如Band4、16、25、37;但同時(shí)還有一些真細(xì)菌不適應(yīng)微好氧條件，條帶消亡如Band19，說明它代表的細(xì)菌不能適應(yīng)微好氧的環(huán)境而逐漸被淘汰.Band16、25 不適應(yīng)PCP 馴化而消亡從而使多樣性指數(shù)下降，說明這些條帶代表的細(xì)菌能夠很好的適應(yīng)微氧的條件，但是它們不能耐受PCP 的毒性，在PCP 的毒性環(huán)境中不能生存. Band4、37 很可能是降解PCP 的優(yōu)勢菌種，Band4 與鞘氨醇單胞菌同源性很高，BEAULIEU 等［13］發(fā)現(xiàn)PCP 污染的土壤中含有的微生物與鞘氨醇單胞菌有關(guān).Band37 與不可培養(yǎng)的放線菌同源性很高，放線菌可以生長在活性污泥中，形成稠的絮狀泡沫，而且它們能夠降解大量不同種類的有機(jī)化合物，對有機(jī)物的礦化有非常重要的作用［14］. Band 17 其在培養(yǎng)過程中一直存在，它們可能對微生物的物質(zhì)和能量代謝起著非常重要的作用.

圖3 真細(xì)菌DGGE 條帶的強(qiáng)度圖Figure 3 Intensities for Eubacteria in DGGE band

圖4 古細(xì)菌DGGE 條帶強(qiáng)度圖Figure 4 Intensities for Archaea in DGGE band

對古細(xì)菌Shannon 多樣性指數(shù)計(jì)算得出接種污泥2.53、微好氧顆粒污泥1.85、PCP 馴化微好氧顆粒污泥1.84，說明部分古細(xì)菌不能適應(yīng)微好氧環(huán)境而消亡如Band26、27，但它們在PCP 馴化的微氧顆粒污泥中則有所增加，很可能是降解PCP 的有效菌種.微好氧顆粒污泥和PCP 馴化顆粒污泥多樣性變化不大，如Band 21 很可能是降解PCP 的優(yōu)勢菌群，它與不可培養(yǎng)的產(chǎn)甲烷古菌具有高達(dá)100%的同源性，任艷紅等［15］曾在降解五氯酚的厭氧反應(yīng)器中分離測序得到產(chǎn)甲烷菌，對PCP 的降解具有非常重要的作用;吳唯民等［16］也對具有還原脫氯性能的顆粒污泥內(nèi)微生物進(jìn)行了鑒定，主要有利用乙酸鹽的產(chǎn)甲烷菌、利用氫的產(chǎn)甲烷菌.DGGE 條帶強(qiáng)度圖表明Band 9 是PCP 馴化后顆粒污泥中新增的特異性條帶，這個(gè)條帶代表的細(xì)菌與鞘氨醇單胞菌同源性很高，可以有效降解五氯酚.Band 28 一直存在但呈現(xiàn)不斷下降的趨勢，說明這一類古菌不能適應(yīng)微氧的環(huán)境或者是PCP 的毒性環(huán)境，而逐漸減少.

3 結(jié)論

(1)構(gòu)建了真細(xì)菌和古細(xì)菌的系統(tǒng)進(jìn)化樹，真細(xì)菌測序的條帶可分為4 大類群，古細(xì)菌測序的條帶可分為3 大類群.

(2)通過比較不同菌的相對數(shù)量變化發(fā)現(xiàn)經(jīng)過五氯酚馴化后產(chǎn)生了一系列對五氯酚降解有利的優(yōu)勢細(xì)菌和古菌，例如Sphingomonas sp.、Actinobacterium、Methanogenic bacterium 以及其它一些Uncultured anaerobic bacterium，它們對五氯酚的降解具有非常重要的作用，是降解PCP 的優(yōu)勢菌種.

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