地毯草黃單胞菌ABB－2對紅掌防御相關生化指標的影響

李淑彬 ，方 茂，林曉云，鐘秀芳

(華南師范大學生命科學學院，廣東廣州510631)

紅掌(Anthurium andraeanum)為世界熱帶、亞熱帶地區(qū)廣泛栽培的著名切花和盆栽觀賞花卉［1］. 紅掌生長喜陰、喜溫熱. 在這種條件下，極易發(fā)生微生物感染而引起侵染性病害.其中，由地毯草黃單胞菌(Xanthomonas axonopodis)引起的細菌性葉斑病(Bacterial blight)是紅掌的致命病害［1－4］.該病害最早于1960年在巴西發(fā)現(xiàn)［2］.目前世界上所有紅掌種植地區(qū)均有該病害. 我國自90年代引種栽培以來，在廣東、云南、海南等紅掌主栽省份也相繼報道該病發(fā)生，一些重病區(qū)發(fā)病率高達100%［4］.由于紅掌植物對目前使用的化學殺菌劑特別是含銅制劑極為敏感，而細菌性葉斑病菌對大多數(shù)抗生素有很強抗性［1－4］，對該植物病害尚無有效的防治藥物和防治措施，該病的發(fā)生是制約紅掌產(chǎn)業(yè)發(fā)展最重要因素.抗病品種的選育和種植是目前唯一有效的防治措施.

研究植物在病菌侵染后寄主防御相關生理、生化的動態(tài)變化是了解病原菌與寄主相互作用生化機制、提高植物抗病品種選育中選擇準確性和育種效率的基礎.目前，相關研究在多種經(jīng)濟作物和果蔬植物如水稻［5］、玉米［6］、白菜［7］、香蕉［8］、芒果［9］、番茄［10］等已有大量報道.對紅掌植物在病菌侵染下防御體系的動態(tài)變化報道尚少［11－12］.

本論文報道一株新近分離的地毯草黃單胞菌ABB－2(X. axonopodis ABB－2)對紅掌主栽品種“阿拉巴馬”(Alabamb)的致病性，并對該病菌侵染后紅掌防御相關主要生化指標的動態(tài)變化進行了研究，以期為了解紅掌與寄主相互作用生化機制、選育抗病品種提供參考.

1 材料與方法

1.1 供試菌株及菌懸液接種物制備

X.axonopodis ABB－2 由本實驗室從廣州某紅掌種植基地細菌性葉斑病紅掌典型病株葉片分離、鑒定并保藏. 保藏的X. axonopodis ABB－2 轉(zhuǎn)接到新鮮牛肉膏蛋白胨斜面，于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后用無菌蒸餾水將斜面上X.axonopodis ABB－2 細胞洗下，并用無菌蒸餾水稀釋到OD600=0.6(X.axonopodis ABB－2 細胞數(shù)大約為每mL 108菌落形成單位(CFU/mL).

1.2 供試紅掌及栽培管理

健康、生長一致的紅掌主栽品種“阿拉巴馬”(Alabamb)從廣州某紅掌種植基地購買，立即單株移栽到塑料盆中，移栽基質(zhì)為m(泥炭土)∶m(沙土)=3∶1，移栽前基質(zhì)121 ℃滅菌1 h.每7 d 施用營養(yǎng)液(m(N)、m(P)、m(K)=20∶10∶20)1 次，每3 d 澆水1 次. 溫室的空氣相對濕度為80%～85%、溫度(28 ±4)℃，適應培養(yǎng)7 d 后于華南師范大學蘭花中心溫室中開始實驗.

1.3 X.axonopodis ABB－2 對紅掌致病性研究

1.3.1 離體葉片感染試驗 取健康紅掌植株葉片先用自來水沖洗表面雜物及灰塵，用無菌解剖刀片將葉片切成約6 cm2，放入無菌培養(yǎng)皿中(預先加入適量無菌水保持濕度)玻璃支架上. 將配好的病菌懸液(1 mL)均勻噴灑到葉片表面.無菌水處理作為正常對照，置于28 ℃、晝夜光照時間12 h/12 h 的恒溫光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng). 定期觀察葉片狀況，統(tǒng)計12個重復接種葉片的病葉率(病葉數(shù)/12 ×100%).

1.3.2 盆栽感染實驗 每株紅掌挑選3～4 片大小一致的葉片.于每一選擇的葉片正面均勻噴灑3 mL新鮮配好的菌懸液，接種后移入試驗溫棚，用保鮮袋套袋3 d 后移去保鮮袋.按照1.2 方法進行管理.共計接種6 盆植株22個葉片. 定期觀察植株生長狀況，統(tǒng)計每一植株的病葉數(shù)目并計算接種葉片的病葉率(病葉數(shù)/植株接種葉片數(shù)×100%)及總病葉率(病葉數(shù)/植株總?cè)~片數(shù)×100%).

1.4 病菌X. axonopodis ABB 誘導寄主防御相關生化指標測定

1.4.1 病菌接種及樣品制備 按照1.3.2 的方法每株挑選2 片大小一致的葉片，用X. axonopodis ABB 接種.接種后第0、2、4、6、8、10、12、14、16 天，剪取未接種的葉片，用蒸餾水清洗干凈、濾紙吸干水后剪去葉片主脈. 參照王學奎的方法［13］，準確稱取0.5 g 葉片置于預冷的研缽中，加入4 mL 預冷的0.1 mol/L pH 8.8 硼酸緩沖液(含1 mmol/L 的EDTANa2)以及少量的石英砂和聚乙烯吡咯烷酮，冰浴研磨成均漿，移至離心管中，再用2 mL 的提取緩沖液沖洗殘留部分后合并，4 ℃、11 000 r/m 離心20 min，上清液即用于分析.每個測定3個重復.

1.4.2 防御相關生化指標的測定 可溶性蛋白含量采用考馬氏亮藍染色法測定［14］，以牛血清蛋白作標準曲線，計算蛋白質(zhì)含量，單位為每g 鮮重中蛋白質(zhì)的mg;超氧化物歧化酶(SOD)活性測定參照王學奎的方法［13］，以抑制50%NBT 光化還原為1個酶活單位(U);過氧化物酶(POD)活性測定參照王學奎的方法［13］，以愈創(chuàng)木酚－30% H2O2為底物測定，每分鐘OD 值變化0.01 為1個POD 酶活單位(U);多酚氧化酶(PPO)活性測定參照王學奎的方法［13］，以鄰苯二酚為底物測定，每分鐘OD 值變化0.01 為1個POD 酶活單位(U);苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性測定參照李合生的方法［15］，以L－苯丙氨酸為底物測定，以每小時內(nèi)OD290變化0.01 為1個酶活性單位(U);游離酚含量參照羅曉芳等采用Folin 酚還原法測定［16］，以沒食子酸作為標準樣品建立總酚含量標準曲線. 樣品中游離酚含量用每g鮮組織所含沒食子酸的質(zhì)量(mg)表示(mg/g).

2 結(jié)果與分析

2.1 X.axonopodis ABB－2 對紅掌的致病性

在離體葉片試驗中，紅掌葉片在X. axonopodis ABB－2 接種2～3 d 后，細菌性葉斑病葉部感染的典型癥狀—水漬狀病斑開始出現(xiàn)，在第4 天，所有接種的葉片均出現(xiàn)病斑，病葉率達到100%(表1).隨著離體葉片培養(yǎng)時間延長，病斑面積不斷擴大，病斑顏色加深逐漸成灰褐色，在感染第10 天后幾乎整個葉片呈茶褐色腐爛(圖1). 盆栽感染實驗顯示了與離體葉片感染實驗一致的結(jié)果.該病菌接種3～4 d后，被接種葉片背面出現(xiàn)水漬狀病斑，隨著感染時間的延長病斑逐漸擴展、中心顏色轉(zhuǎn)變?yōu)楹诤稚?從接種后第8 天開始，所有接種的葉片均出現(xiàn)病斑，接種葉片的病葉率達到100%. 且未直接接種葉片也開始出現(xiàn)病斑，在第16 d 植株中65%以上的葉片出現(xiàn)病斑.顯示X. axonopodis ABB－2 對紅掌“阿拉巴馬”具有較強的致病性.

表1 X.axonopodis ABB－2 接種紅掌后病葉的發(fā)生率Table 1 Percentages of leaves with lesion of A. andraenum cultivar‘Alabamb’after inoculation with X. axonopodis ABB－2

圖1 X.axonopodis ABB－2 對紅掌“阿拉巴馬”的致病性Figure 1 Pathogenicity of X.axonopodis ABB－2 on A.andraenum cultivar‘Alabamb’

2.2 X. axonopodis ABB－2 對紅掌可溶性蛋白含量的影響

在X.axonopodis ABB－2 感染后，紅掌葉片可溶性蛋白含量在首先的12 d 內(nèi)有一個持續(xù)而緩慢的增加(圖2)，在接種后的第12 天，其可溶性蛋白含量相比非接種對照所有測試的平均值增加了21.76%.隨后逐漸下降，第16 天的含量仍然顯著高于非接種對照(P ＜0.01).

圖2 X.axonopodis ABB－2 誘導紅掌可溶性蛋白含量的動態(tài)變化Figure 2 Changes in soluble protein content in the leaves of inoculated Anthurium plant with X.axonopodis ABB－2 and control Anthurium plant

2.3 X. axonopodis ABB－2 對紅掌SOD、POD、PPO 和PAL 活性的影響

在X.axonopodis ABB 接種后前一階段，紅掌葉片SOD 活性快速增加，侵染后第4 d 達到峰值，較非接種對照SOD 活性測定的平均值增加了15.37%;隨后急劇而持續(xù)的下降，至測試周期結(jié)束時(病菌接種后的第16 d)，其活性僅為非接種對照的55.46%(圖3A).

X.axonopodis 接種后，紅掌葉片POD 活性呈現(xiàn)于其SOD 活性相似的動態(tài)變化(圖3B). 該病菌接種后的0～6 d，紅掌葉片POD 活性逐漸增加，在第6天達到活性峰值，較非接種對照平均值增加了36.62%，隨后緩慢持續(xù)下降，在第12 天其活性下降到與非接種對照接近. 而在測試周期結(jié)束時(病菌接種后的第16 天)，POD 活性下降到僅為非接種對照73.36%的水平.

X.axonopodis 接種同樣誘導了PPO 活性的升高，其活性峰值出現(xiàn)在該病菌感染后的第8 天，其較非接種對照平均值增加了51.89%(圖3C).隨后逐漸下降，至測試周期結(jié)束時(病菌接種后的第16天)，PPO 活性回復到接種前的水平.

X.axonopodis ABB 接種后紅掌葉片PAL 活性一直呈現(xiàn)出平穩(wěn)增加的狀態(tài)，其活性峰值出現(xiàn)在病菌感染后的第12 天，其活性與接種前比較增加了66.43%(圖3D).隨后逐漸下降，但在測試周期結(jié)束的最后一天(第16 天)，該酶活性仍然顯著高于非接種對照(P ＜0.01).

2.4 X. axonopodis ABB－2 對紅掌游離酚含量的動態(tài)變化

X.axonopodis ABB 接種后測試周期，紅掌葉片游離酚含量一直呈現(xiàn)平穩(wěn)增加的狀態(tài)(圖4)，接種后16 d，其含量較對照增加了34.66%.

3 討論

本研究中，X. axonopodis ABB－2 接種紅掌“阿拉巴馬”后，葉片呈現(xiàn)典型的細菌性葉斑病葉部感染癥狀，且病情發(fā)展迅速(圖1、表1).此外，該病菌接種后，不僅引起紅掌葉部感染，而且其花絮也出現(xiàn)黑褐色病斑(結(jié)果未顯示). 這些結(jié)果說明X. axonopodis ABB－2 為紅掌細菌性葉斑病的強毒病原，與該病菌分離自紅掌“阿拉巴馬”細菌性葉斑病典型病株一致.

圖3 X.axonopodis ABB－2 誘導寄主紅掌不同酶活性的動態(tài)變化Figure 3 Changes in different enzyme activities in the leaves of inoculated Anthurium plant with X.axonopodis ABB－2 and control Anthurium plant

圖4 X.axonopodis ABB－2 誘導寄主紅掌游離酚含量的動態(tài)變化Figure 4 Changes in free phenol content in the leaves of inoculated Anthurium plant with X. axonopodis ABB－ 2 and control Anthurium plant

SOD 和POD 是植物細胞內(nèi)抵御活性氧(Reactive oxygen species，ROS)傷害的2 種主要保護酶，其活性變化可間接反映植物體內(nèi)活性氧代謝的變化，也常作為植物抗病性的重要指標［5－8，17］. 植物受到病害侵染后，會產(chǎn)生大量的ROS，ROS 的積累將激發(fā)植株體內(nèi)抗氧防御相關合成酶基因的表達，表現(xiàn)為抗氧化酶活性上升. 在本研究中，X. axonopodis ABB－2 感染紅掌“阿拉巴馬”后同樣誘導了寄主紅掌葉片SOD 和POD 的增加，間接說明該病菌感染引起了“阿拉巴馬”紅掌植株ROS 的迸發(fā). ROS 迸發(fā)是植物受到病原菌侵害時，最快的防衛(wèi)反應之一［17］.X.axonopodis ABB－2 感染紅掌“阿拉巴馬”后，隨著感染時間的延長，病情發(fā)展加劇，而被感染的植株葉片SOD 和POD 活性在感染的中后期迅速而持續(xù)下降到低于非接種對照的水平. 這個結(jié)果提示ROS 迸發(fā)并不足以殺死紅掌所感染的X.axonopodis ABB－2 病菌，相反，該病菌在該植株內(nèi)的增殖破壞了該植株的抗氧化防御系統(tǒng)，使之活性顯著降低.過多的活性氧積累對植物也具有嚴重的毒害作用，甚至導致細胞或植株死亡［17］. 本研究的結(jié)果也初步提示感染后活性氧產(chǎn)生與清除動態(tài)平衡的破壞可能也是X.axonopodis 對紅掌致病性的因素之一.

多酚氧化酶可催化木質(zhì)素及其它酚類氧化產(chǎn)物的形成而發(fā)揮抗病作用［8］.苯丙氨酸解氨酶是苯丙氨酸代謝的第一關鍵酶，與包括木質(zhì)素、香豆素、黃酮、類黃酮衍生物等在內(nèi)的植物抗毒素的合成密切相關［18］.對PAL、PPO 與植物抗病性的關系，大多報道認為該二種酶在植株受病原菌侵染后其活性升高，并與抗病性呈正相關［5－10］. 在本研究中，X. axonopodis ABB－2 感染紅掌“阿拉巴馬”后，紅掌葉片PPO 活性升高達到一個峰值后下降到非接種對照植株水平，與大多數(shù)報道一致.而該病菌感染后紅掌葉片PAL 活性達到最大值，且該酶維持高活性的時間明顯大于其他所測試的防御相關酶，提示該病菌誘導紅掌PAL 活性的提高可能是紅掌抗細菌性葉斑病的重要因素.植物細胞內(nèi)存在的酚類化合物可通過抑制病菌生長、病原物毒素及酶的產(chǎn)生或使其鈍化等多種方式參與對病原的抵御. 本研究中，病菌X.axonopodis ABB 接種誘導了紅掌葉片游離酚含量持續(xù)的增加. 稻黃單胞菌菌侵染寄主水稻后也引起寄主游離酚含量顯著增加，與目前的研究結(jié)果一致［5］.

病程相關蛋白(PRP)是植物受病原物或不同因子刺激、脅迫所產(chǎn)生的一類具有廣譜抗性的可溶性蛋白質(zhì).植物在病原脅迫下組織中可溶性蛋白含量的變化可間接反映PRP 的變化.本研究中，病菌X.axonopodis ABB 接種后紅掌葉片可溶性蛋白含量其最大值較非接種對照增加了21.76%，提示該病菌感染可誘導紅掌PRP 的表達.但該病菌接種后紅掌PRP 中各個成員的表達及其差異有待進一步驗證和研究.

革蘭氏陰性病原細菌大多能分泌Harpin 類蛋白，許多研究發(fā)現(xiàn)該類蛋白能激活寄主、非寄主抗病防衛(wèi)、生長防御相關的多條信號途經(jīng)［19］. 在前期工作中作者發(fā)現(xiàn)X.axonopodis ABB－2 能合成Harpin蛋白.X.axonopodis ABB－2 誘導寄主紅掌抗病、防御相關生化指標的升高是否由Harpin 蛋白介導有待進一步研究.

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