一株高產(chǎn)油脂微生物菌種的篩選與鑒定

陳士華 ，孫 強(qiáng) ，孫莉云 ，吳興泉 *

（1.河南工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001；2.黑龍江北大荒農(nóng)業(yè)股份有限公司 八五四分公司，黑龍江 虎林 158403）

0 引言

產(chǎn)油微生物可利用碳源及其他必需營養(yǎng)物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)合成并大量儲存油脂，其油脂積累量可超過細(xì)胞總量的20%[1].研究表明，細(xì)菌、酵母、霉菌、藻類等多種微生物均可生產(chǎn)油脂，產(chǎn)生的油脂多為C16和C18的不飽和脂肪酸，其中一些還能生產(chǎn)功能性多不飽和脂肪酸，而且證明微生物油脂含有更多的功能性不飽和脂肪酸，比動、植物油脂更符合人們需要.在篩選高產(chǎn)油脂微生物菌種的同時(shí)，利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)某些功能性油脂的相關(guān)研究也隨之展開.現(xiàn)已獲得了一系列的油脂含量高并富含亞麻酸的菌株，并建立了高密度發(fā)酵法生產(chǎn)亞麻酸的技術(shù)體系[2].微生物油脂的發(fā)酵生產(chǎn)過程具有可人工操作、便于控制、生產(chǎn)周期短、不受季節(jié)限制、便于大規(guī)模連續(xù)生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn).微生物油脂在醫(yī)藥、食品、飼料、化工、能源等多個(gè)行業(yè)具有非常廣闊的應(yīng)用前景[3].

近年來，人們致力于高產(chǎn)油脂微生物菌種的選育研究，已經(jīng)獲得多種高產(chǎn)油脂的微生物菌種[4].在眾多產(chǎn)油微生物中，霉菌受到的關(guān)注最為廣泛，研究也較為深入，因?yàn)槊咕椭扛撸缓?亞麻酸（GLA）和花生四烯酸（ARA）等功能性多不飽和脂肪酸[5].目前研究較多的有高山被孢霉、深黃被孢霉、長被孢霉、小克銀漢霉、樟疫霉、水霉、輪枝霉、魯氏毛霉、卷枝毛霉、畸雌腐霉、終極腐霉、破囊壺菌、頭孢霉等[6].霉菌的油脂含量多在20%～25%之間，超過25%的霉菌種類較少.本研究分離、鑒定了一株可高產(chǎn)油脂的深黃傘形霉，其油脂含量可達(dá)48.77%，為微生物油脂的開發(fā)和利用奠定了基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 帶菌土樣的采集

在河南工業(yè)大學(xué)及周邊地區(qū)采集富含油脂的土壤樣本6份.取富含油脂及糖類的土壤，用取樣鏟除去表層5 cm左右的浮土，取5～15 cm處的土樣50～100 g，裝進(jìn)準(zhǔn)備好的塑料袋內(nèi)扎好，編號并記錄采樣地點(diǎn)、土壤質(zhì)地、時(shí)間和其他的環(huán)境條件，取回樣品后馬上進(jìn)行霉菌分離[7].

1.2 培養(yǎng)基配方

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，水1 000 mL，瓊脂20 g.種子培養(yǎng)基：酵母粉10 g，蛋白胨10 g，葡萄糖20 g，水1 000 mL.發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖40 g，（NH4）2SO42 g，KH2PO47 g，NaH2PO42 g，酵母粉 1 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，水 1 000 mL.

1.3 菌株篩選

1.3.1 平板初篩

取10 g土樣放入裝有玻璃珠和90 mL無菌生理鹽水的三角瓶中，在振蕩器上振蕩 20 min左右，靜置，制成稀釋10倍的土壤懸液；在無菌條件下，連續(xù)稀釋，制成 10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的稀釋土壤懸液.無菌條件下，取上述各梯度的稀釋液0.1 mL涂布PDA平板培養(yǎng)基，每個(gè)稀釋度涂布3個(gè)平板，28℃恒溫倒置培養(yǎng)4～6 d，然后分離純化霉菌.

1.3.2 油脂粒的染色觀察

蘇丹黑B染色液的配制：稱取0.3 g蘇丹黑B（廈門綠茵試劑公司），溶于100 mL 70%（V/V，下同）乙醇中，室溫放置5 d，期間經(jīng)常搖動使其充分溶解，過濾后于4℃下保存?zhèn)溆?Giemsa染液的配制：稱取吉姆薩粉（Giemsa stain）l.0 g，甘油 66 mL，甲醇 66 mL，將吉姆薩粉放入研缽中，先加入少量甘油，研磨至無顆粒為止，然后再將全部甘油倒入，置于56℃溫箱中2 h后，加入甲醇，將配制好的染液密封在棕色瓶內(nèi)4℃保存.

油脂粒的染色觀察：從平板培養(yǎng)基上選取單菌落，挑取少許菌絲涂片，熱固定，加入一滴蘇丹黑B染色液染色l5 min，傾去染料，用二甲苯?jīng)_洗至洗脫液無色，再用Giemsa染液復(fù)染2 min，水洗、吸干后鏡檢.根據(jù)油滴顆粒大小及密集程度作出產(chǎn)油脂量的評價(jià)，并做好觀察記錄.根據(jù)油滴顆粒大小和密集程度作出產(chǎn)油脂量的評價(jià)，以“+”來評價(jià)產(chǎn)油脂量，如果染色后胞內(nèi)藍(lán)黑色顆粒非常少，有很少油滴記為“+”；藍(lán)黑色顆粒稍多，有小油滴記為“++”；藍(lán)黑色顆粒稍多，小油滴較多記為“+++”；孢子分散，染色很深，油脂很多記為“++++”；鏡檢脂肪粒大且多的霉菌接種于PDA斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)和后續(xù)的搖瓶復(fù)篩.

1.3.3 搖瓶復(fù)篩

挑取保存于斜面培養(yǎng)基上的少量菌絲或孢子，接種于另一PDA斜面培養(yǎng)基上，于28℃培養(yǎng)3～5 d，直至長出大量孢子.用無菌水沖洗斜面上的孢子并用移液器分別吸取50μL接入50 mL的液體種子培養(yǎng)基中，于28℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h.然后將種子液按10%的比例接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中（250 mL三角瓶的裝液量為40 mL），放在28℃，180 r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)5～7 d[9].用布氏漏斗過濾發(fā)酵液并將所得到的菌體收集起來，干燥后稱質(zhì)量，然后計(jì)算干菌體得率.再稱取一定量的干菌體，用酸熱法將干菌體中所含油脂抽提出來，并測定其質(zhì)量，從而計(jì)算出油脂含量和油脂得率.從中選出油脂含量高且穩(wěn)定的菌株，并對該菌株進(jìn)行分子鑒定，以確定其種屬.

1.4 生物量測定

搖瓶發(fā)酵6 d后，測定發(fā)酵液的總體積，并用布氏漏斗抽濾得到菌絲體.稱取菌絲體的質(zhì)量，并置于鼓風(fēng)干燥箱中50℃烘干至質(zhì)量不再變化，準(zhǔn)確稱菌體的質(zhì)量.

干菌體得率的計(jì)算：

1.5 油脂提取

酸熱法提取微生物油脂[10-11]：用研缽將干菌體研磨碎，精確稱取一定量干菌體放入100 mL的三角瓶中，每克干菌體添加40 mL鹽酸（4 mol/L），室溫下放置30 min，沸水浴10 min，然后置于-20℃下速冷，沸水浴和速冷可重復(fù)操作3～4次.然后加入2倍體積的氯仿-甲醇，充分振蕩后在4 000 r/min下離心12 min，用已知質(zhì)量的離心管收集氯仿層，在60℃水浴中蒸干氯仿，80℃烘干1.5 h，冷卻稱質(zhì)量即得油脂質(zhì)量.

1.6 高產(chǎn)油脂微生物菌種的鑒定

1.6.1 菌種的形態(tài)學(xué)觀察

觀察菌株在平板培養(yǎng)基上的顏色、厚薄、質(zhì)地、形狀等菌落形態(tài)特征，并記錄.在顯微鏡下觀察菌株的分生孢子、分生孢子梗及產(chǎn)孢器等各種性狀，并記錄.

1.6.2 菌種的分子鑒定

從保存的斜面上挑取菌絲體接種到40 mL的PDA液體培養(yǎng)基中，28℃，150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h.采用EE101-01 50型的DNA提取試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司）進(jìn)行DNA的提取.采用真菌ITS序列通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'） 和 ITS4 （5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'），PCR 擴(kuò)增出包括 ITS1、5.8 S rDNA和ITS2的全長DNA片段.PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3 min；94℃變性 30 s，60℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，32個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 10 min.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，在上海生工生物工程有限公司進(jìn)行序列測定.采用BLAST工具進(jìn)行序列比對分析，確定待測菌株的屬種.

2 結(jié)果與分析

2.1 霉菌分離純化與平板初篩

從6份土壤樣品中共分離、純化出11種霉菌.用接種針分別從平板上挑取一定量的孢子，用蘇丹黑B染液染色，鏡檢觀察，部分鏡檢結(jié)果見圖1.根據(jù)油滴顆粒大小和密集程度作出產(chǎn)油脂量的評價(jià)，最終分離出7株產(chǎn)生油脂的霉菌（見表1）.將評價(jià)為“++”及以上的霉菌作為實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)菌株，共得到7株，進(jìn)行搖瓶復(fù)篩試驗(yàn).

圖1 蘇丹黑B染色結(jié)果

2.2 搖瓶復(fù)篩結(jié)果

對以上7株菌株經(jīng)搖瓶培養(yǎng)后，酸熱法抽提油脂，測定生物量、油脂含量和油脂得率，結(jié)果見表2.

表1 蘇丹黑B染色法觀察菌株的結(jié)果

表2 搖瓶復(fù)篩結(jié)果

以油脂含量（%）和油脂得率（g/L）為指標(biāo)，油脂含量高于25%的霉菌為鄭1303-2、鄭1303-6、鄭1303-8、鄭1303-9，其中菌株鄭1303-9油脂含量最高（48.77%），油脂得率最高（5.42 g/L），鄭1303-8油脂含量其次（28.83%），油脂得率為4.00 g/L，選擇油脂含量最高的菌株鄭1303-9進(jìn)行分子鑒定.

研究表明，進(jìn)行產(chǎn)油脂微生物菌種篩選時(shí)，采用蘇丹黑B染色法進(jìn)行初篩具有可批量處理、操作簡單等優(yōu)點(diǎn).采用酸熱法進(jìn)行粗油脂含量的測定可以滿足在菌種篩選階段對油脂抽提的基本要求，而且較索氏抽提法操作簡便、可批量處理，從而使產(chǎn)油脂真菌篩選的整個(gè)過程得以大大簡化.

2.3 菌株鄭1303-9的鑒定

2.3.1 菌株鄭1303-9的形態(tài)學(xué)鑒定

菌株鄭1303-9生長速度比較慢，4 d后菌落直徑為2.1 cm，正反面顏色相近，正面為灰黃色，反面為淺黃色，菌絲長的比較集中，相對致密，并且從菌落中心向菌落邊緣出現(xiàn)很多像樹的年輪一樣的圈，一周后菌落直徑也只有很小的變化.

2.3.2 菌株鄭1303-9的分子生物學(xué)鑒定

用北京全式金生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的EE101-01 50型的DNA提取試劑盒提取出霉菌的DNA，以ITS1和ITS4為引物，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增出5.8 S rDNA/ITS區(qū)段，并將擴(kuò)增片段用1.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，電泳結(jié)果見圖2.

圖2 菌株鄭1303-9 5.8S rDNA/ITS區(qū)段的PCR擴(kuò)增

由圖2可以看出，成功擴(kuò)增出鄭1303-9菌株的5.8S rDNA/ITS片段，純化PCR產(chǎn)物在上海生工生物工程有限公司測序，獲得鄭1303-9菌株的5.8 S rDNA/ITS區(qū)段序列為5′-ctttcactcgaaagatcttttc ctttgtgctggctttgaccgtatgtaattttgggacttaaacatggtaaagccttatgg tttggccggtcccaaaaacaatatatcatccttatgaaaaacttactgaacaacta aacaatgattttaataatctgtttaaaacaactttcaacaacggatctcgtggttctc gcatcgatgaaaaacgcagcgaaatgcgatacgtagtgtgaattgcaaaattcag tgaatcatcaaatctttgaacgcacattgcactccttggtattccgaggagtatgcc tgtttcaatatcatgagcactctcacacctaacctttgggttatgctgtggaattgag atgcgcctatttttactactcggcactcctaaaatgtagctcttggctgtttcctacta cagcattttggcctaatagttttgacttttgtcaaatctttggctacttttgcttctggaa atcactcttgataatacagaaaactcatttcaaactttgatctgaaatcaggtaggg ctacccgctgaacttacgcatatcaataagcggagga-3′. 經(jīng) BLAST分析證明鄭1303-9 5.8 S rDNA/ITS區(qū)段序列與深黃傘形霉（Umbelopsis isabellina）相應(yīng)序列（Genbank序列號EU816388.1）相似度可達(dá)96%，確定鄭C1303-9菌株為深黃傘形霉.這與前人的研究成果相同[12-13].

3 結(jié)論

篩選得到1株產(chǎn)油脂含量高達(dá)48.77%的真菌菌株鄭1303-9，綜合菌株的菌落形態(tài)和分子鑒定結(jié)果，證明該菌株為深黃傘形霉.深黃傘形霉鄭1303-9菌株具有油脂產(chǎn)量高、生物量較大等特點(diǎn)，具有極高的研究價(jià)值和應(yīng)用潛力.

［1］ 何東平，陳濤．微生物油脂學(xué)［M］．北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2006：2-24．

［2］ 陸步詩，李新社，范平．二步發(fā)酵丟糟生產(chǎn)微生物油脂的研究［J］.生物技術(shù)，2012（5）：79-82．

［3］ 薛飛燕，張栩，譚天偉．微生物油脂的研究進(jìn)展及展望［J］．生物加工過程，2005，3（1）：23-27．

［4］ 顏治，陳晶．微生物油脂及其開發(fā)利用研究進(jìn)展［J］．糧食與油脂，2003（7）：13-15．

［5］ 孫志芳，高蔭榆，鄭淵月．功能性油脂的研究進(jìn)展［J］．中國食品添加劑，2005（3）：4-7．

［6］ Papanikolaous，M Komaitis，G Aggelis．Single cell oil（SCO）production by Mortierella isabe nin grown on high-sugar content media［J］．Bioresour Technol，2004，95:287-291．

［7］ 史海粟，王際輝，葉淑紅，等．產(chǎn)功能性油脂微生物的篩選及鑒定［J］．中國油脂，2010（4）：24-27．

［8］ 劉吉華，袁生，戴傳超．一種新的絲狀真菌油脂含量快速鑒定方法［J］．生物技術(shù)，1998，8（1）：43-44．

［9］ 葉思特，郭麗瓊，劉曉蓉，等．產(chǎn)油微生物的篩選［J］．華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，33（3）：384-387，397．

［10］曹健，汪晨輝，曾實(shí)．卷枝毛霉Mucor circinelloides 3.2208油脂幾種提取方法的比較［J］．中國油脂，2004，29（4）：38-40．

［11］孔幾敏，趙祥穎，田延軍，等．酸熱法提取酵母油脂條件的研究［J］．中國釀造，2010（5）：143-146．

［12］鄭紅波，劉光華，李昕然，等．產(chǎn)油脂微生物菌種的篩選、鑒定及其油脂組成分析［J］．四川大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2010，47（6）：1397-140．

［13］何容，趙環(huán)，楊云喜，等．深黃傘形霉（Umbelopsis isabellina）華2-1產(chǎn)油發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化［J］．應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2012，18（1）：80-85．