采前噴施拮抗菌羅倫隱球酵母對草莓保鮮效果的影響

毛淑波，朱 娜，韋瑩瑩，曹澤斌，雷 云，吳林蔚，屠 康

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，農(nóng)業(yè)部農(nóng)畜產(chǎn)品加工與質(zhì)量控制重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京210095）

草莓（Fragaria×ananassa Duch.）屬薔薇科草莓屬，為漿果類水果。果實(shí)色澤艷麗、柔軟多汁、營養(yǎng)價(jià)值極高，深受消費(fèi)者喜愛。但其含水量高[1]，組織嬌嫩，在采摘和貯運(yùn)過程中極易受到機(jī)械損傷和微生物侵染而腐爛變質(zhì)，因此不易貯藏和運(yùn)輸[2]。由灰葡萄孢（Botrytis cinerea）引起的灰霉病及由匍枝根霉（Rhizopus stolonifer）引起的軟腐病是導(dǎo)致草莓果實(shí)采后腐爛的主要病害[3]。目前最主要的控制措施有氣調(diào)、輻射、熱、低溫和化學(xué)藥物處理等[4-5]。近年來，利用微生物防治果蔬采后病害已成為一種新的途徑[6]。其中酵母菌由于具有抑菌譜廣、拮抗效果好、遺傳穩(wěn)定、營養(yǎng)要求低，一般不產(chǎn)生對人和寄主植物有害的代謝產(chǎn)物，安全性高等優(yōu)點(diǎn)而成為果蔬采后病害生物防治研究的熱點(diǎn)[7-11]。由于部分的采后病原微生物早在果蔬田間生長時(shí)期就已經(jīng)侵入花或者果實(shí)，而采前應(yīng)用拮抗酵母菌可以減少果蔬在田間生長期間受到潛伏性病原菌的侵染，并有效防止果蔬采后貯運(yùn)過程中病原菌的二次侵染[12]。因此，在果蔬采摘之前、田間生長時(shí)噴施拮抗酵母來抑制果蔬采后貯藏期間病害將是拮抗微生物應(yīng)用的重要領(lǐng)域之一。羅倫隱球酵母（Cryptococcus laurentii）在果實(shí)表面具有較強(qiáng)的生長定殖能力，而且對田間環(huán)境和采后低溫低氧及高CO2都具有很強(qiáng)的適應(yīng)能力，比較適合采前應(yīng)用。許多研究表明，采前應(yīng)用拮抗酵母羅倫隱球能有效地減少梨[13]、甜櫻桃[14]、葡萄[15]、番茄[16]、柑橘[17]等果實(shí)采后貯藏期間病害的發(fā)生。但是關(guān)于拮抗酵母采前噴施對草莓采后腐爛和品質(zhì)的影響未見報(bào)道，本文通過研究采前應(yīng)用羅倫隱球酵母對草莓采后病害的控制和貯藏品質(zhì)的影響，以期為拮抗酵母的采前應(yīng)用控制果蔬采后病害提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

草莓果實(shí) 品種為“豐香”，種植于南京市江心洲白鷺生態(tài)園，種植期間大棚內(nèi)晝夜溫度范圍約為8～25℃。

分析天平AR64CN 奧豪斯儀器有限公司；物性測試儀（質(zhì)構(gòu)儀）TA-XT2 英國Stable Micro Systems公司；臺(tái)式pH計(jì)pH610 新加坡Trans Wiggens公司；數(shù)字折光儀TD-45 浙江托普儀器有限公司；色彩色差計(jì)CR-200 日本柯尼卡美能達(dá)控股公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌懸液的制備 拮抗酵母羅倫隱球（C.laurentii）的培養(yǎng)：由中國普通微生物菌種保藏管理中心提供并置于4℃下NYDA（牛肉膏8g，酵母浸膏5g，葡萄糖10g，瓊脂15g，水1000mL）培養(yǎng)基上保藏，使用時(shí)從NYDA斜面上取一環(huán)于培養(yǎng)基平板上劃線后在28℃下培養(yǎng)24h，再用接種環(huán)取一環(huán)于盛有50mL NYDB培養(yǎng)基（不加瓊脂的NYDA）的250mL三角瓶中，在28℃下200r·min-1振蕩培養(yǎng)24h。拮抗酵母菌懸液的制備方法是將培養(yǎng)好的酵母細(xì)胞于4℃、6000g下冷凍離心10min，并用無菌水清洗兩次以去除培養(yǎng)基，之后用無菌水（含有0.05%Tween-80）將酵母細(xì)胞的濃度調(diào)整為108CFU/mL（CFU：菌落形成單位Colonyforming Units）。

病原菌的培養(yǎng)：灰葡萄孢霉（B.cinerea Pers.），為實(shí)驗(yàn)室保藏菌種，從自然發(fā)病的草莓果實(shí)表面分離得到，置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基上生長或保存。使用前病原菌接種到PDA培養(yǎng)基上在26℃下活化培養(yǎng)7～10d之后，用無菌水（含有0.05%Tween-80）洗脫孢子，借助于血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整至濃度為105個(gè)/mL的孢子懸浮液，備用。

1.2.2 果實(shí)采前噴施拮抗酵母實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 本次實(shí)驗(yàn)在南京市江心洲白鷺生態(tài)園進(jìn)行，所選用的草莓果實(shí)品種為“豐香”，拮抗酵母（C.laurentii）菌懸液的濃度為108CFU/mL（含有0.05%Tween-80），對田間的草莓果實(shí)進(jìn)行噴灑拮抗酵母。采用塑料小噴壺，并調(diào)節(jié)噴頭以控制每次噴施量，使每次噴施量在0.5mL左右，將菌懸液均勻地噴施于草莓果實(shí)的正反面。

實(shí)驗(yàn)總共分為四個(gè)處理組：CK組：草莓果實(shí)商業(yè)成熟采摘之前不進(jìn)行噴施；A組：草莓果實(shí)商業(yè)成熟采摘之前6d（始紅期）用拮抗酵母菌懸液對草莓果實(shí)進(jìn)行噴施；B組：草莓果實(shí)商業(yè)成熟采摘之前6d（始紅期）+采摘當(dāng)天（紅熟期）分別用拮抗酵母菌懸液對草莓果實(shí)進(jìn)行噴施；C組：草莓果實(shí)商業(yè)成熟采摘之前6d（始紅期）+采摘之前3d（半紅期）+采摘當(dāng)天（紅熟期）分別用拮抗酵母菌懸液對草莓果實(shí)進(jìn)行噴施；每個(gè)處理組的草莓植株為65棵，草莓果實(shí)商業(yè)成熟后采摘，之后于2h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，不同處理組的草莓果實(shí)分別放置于塑料盒中，并覆上保鮮膜以保持約95%的相對濕度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.2.3 采前噴施拮抗酵母對草莓采后灰霉病和自然病害的防治實(shí)驗(yàn) 采摘回來的果實(shí)經(jīng)過挑選之后分成兩部分，一部分用于人工接種病害實(shí)驗(yàn)，果子用105個(gè)/mL灰葡萄孢霉孢子懸浮液浸泡5s，晾干后裝入塑料盒，并用保鮮膜覆蓋，用加濕器以保持95%的相對濕度，于20℃貯藏4d，測定果實(shí)的腐爛指數(shù)。另一部分用于自然實(shí)驗(yàn)，果實(shí)直接裝入塑料盒用保鮮膜覆蓋，20℃貯藏4d后測定果實(shí)的腐爛指數(shù)。腐爛指數(shù)的測定參照Cao等[18]的方法。每盒30個(gè)果實(shí)，每次處理30個(gè)果實(shí)。

1.2.4 草莓果實(shí)貯藏期品質(zhì)指標(biāo)的測定 采回來的草莓不接種病原菌，將果實(shí)置于20℃下貯藏4d，在采摘當(dāng)天和貯藏4d后測定以下品質(zhì)指標(biāo)：失重率、硬度、顏色、可滴定酸含量（TA）、可溶性固形物含量（SSC）和維生素C含量。

失重率的測定：采用稱重法，失重率（%）=（貯前果實(shí)質(zhì)量-貯期果實(shí)質(zhì)量）/貯前果實(shí)質(zhì)量×100。

硬度的測定：采用TA-XT2i質(zhì)構(gòu)儀，探頭直徑為5mm，測前和測中速度為1m/s，測后速度為2m/s，下壓距離為5mm，取最大力。每個(gè)果實(shí)取赤道部位2點(diǎn)，每組每次測定10個(gè)果實(shí)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)測定三次。

顏色的測定：采用MINOLTA CR-200色彩色差儀測定果實(shí)表皮顏色的L*、a*和H值。每個(gè)果實(shí)測赤道部位左右對稱四個(gè)點(diǎn)，取平均值。

可滴定酸含量（TA）的測定：用電位滴定法。用0.1mol/L的NaOH滴定至pH8.1，結(jié)果以含檸檬酸的百分?jǐn)?shù)表示。

可溶性固形物（SSC）含量的測定：采用TD-45數(shù)字折光儀測定，每個(gè)水果測定3次，每組測定10個(gè)果子。實(shí)驗(yàn)重復(fù)測定三次。

維生素C含量的測定：采用鉬酸銨比色法[19]。

1.2.5 拮抗酵母果實(shí)表皮生長動(dòng)態(tài)測定 四個(gè)處理組的草莓果實(shí)采回來后不接種病原菌，分別置于外套保鮮膜的塑料盒中，于20℃下貯藏4d。分別在采摘當(dāng)天和貯藏結(jié)束時(shí)測定拮抗酵母（C.laurentii）在草莓果實(shí)表皮的生長動(dòng)態(tài)。每次測定時(shí)，從每個(gè)處理組分別隨機(jī)抽取3個(gè)果實(shí)，稱重，分別置于含有150mL無菌水的250mL錐形瓶中，然后在150r/min的搖床上振蕩20min，接著將洗脫液進(jìn)行梯度稀釋，吸取0.1mL洗脫液并涂布于虎紅瓊脂平板上，并于28℃下培養(yǎng)2d，最后取出平板，根據(jù)酵母生長形態(tài)來計(jì)數(shù)（結(jié)果以lg CFU/g fruit表示）。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理采用SAS 8.2分析系統(tǒng)軟件進(jìn)行方差分析（ANOVA）和鄧肯氏多重比較法（Duncan’s Multiple Range Test）在p=0.05的水平下進(jìn)行檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 采前噴施拮抗酵母對草莓果實(shí)采后灰霉病的防治效果

圖1所示的是采前噴施拮抗酵母對草莓果實(shí)采后常溫貯藏期間灰霉病防治效果。從圖1中可以看出，隨著拮抗酵母采前噴施次數(shù)的增加，草莓果實(shí)在貯藏期間腐爛指數(shù)明顯降低。20℃貯藏4d后，對照組CK的腐爛指數(shù)達(dá)到了78.86%，處理組A和處理組B的腐爛指數(shù)顯著地低于CK組（p＜0.05），而處理組C的腐爛指數(shù)僅為12.55%，比對照組CK減少了68.31%，同樣顯著地低于其余的兩組處理（p＜0.05）。由此說明采前噴施拮抗酵母（C.laurentii）可以有效地降低草莓在室溫環(huán)境貯藏下由于灰霉病引起的腐爛的發(fā)生，且C組效果最好。

圖1 采前噴施拮抗酵母對草莓果實(shí)貯藏期間灰霉病的影響Fig.1 Effect of preharvest C.laurentii treatment on gray mold decay of strawberry fruit caused by Botrytis cinerea

2.2 采前噴施拮抗酵母對草莓果實(shí)采后自然病害防治效果

圖2所示的是采前噴施拮抗酵母對草莓果實(shí)采后常溫貯藏期間自然病害的防治效果。從圖2中可以看出，CK組的草莓在20℃貯藏4d后的腐爛指數(shù)為44.33%，而處理組A的腐爛指數(shù)則為21%，相比于CK組，處理組A的腐爛指數(shù)顯著降低了23.33%（p＜0.05）。處理組B的腐爛指數(shù)為11.33%，顯著地低于CK組和處理組A（p＜0.05），而處理組C的腐爛指數(shù)僅為4.33%，明顯低于其余的三組處理（p＜0.05）。由此可知，采前噴施拮抗酵母C.laurentii能顯著降低草莓自然病害導(dǎo)致的腐爛，且C組效果最好。

圖2 采前噴施拮抗酵母對草莓果實(shí)采后自然病害的影響Fig.2 Effect of preharvest C.laurentii treatment on natural decay of strawberry fruit

2.3 采前噴施拮抗酵母對草莓品質(zhì)的影響

由表1可知，草莓經(jīng)過常溫貯藏后，各組果實(shí)的失重率均增加，但是采前噴施處理組的失重率均低于對照組，且處理組C與對照組之間存在顯著差異（p＜0.05）。由此說明，拮抗酵母處理組能減少果實(shí)失重率，可能是由于采前噴施次數(shù)的增加，拮抗酵母在果實(shí)表皮定殖的數(shù)量增多，有利于其在果實(shí)表面緊密附著形成一層膜，以減少果實(shí)表面的水分蒸騰作用和果實(shí)的皺縮。

硬度是衡量果實(shí)品質(zhì)的重要指標(biāo)之一。在采摘當(dāng)天，噴施處理組果實(shí)的硬度均高于對照組，但各組之間變化較小。貯藏結(jié)束后，對照組果實(shí)的硬度明顯降低，而噴施處理組能維持較好的硬度。

隨著貯藏時(shí)間的延長，草莓果實(shí)的可溶性固形物含量（SSC）、可滴定酸含量（TA）及VC含量均呈下降趨勢。無論在采摘當(dāng)天還是貯藏結(jié)束，各組之間的SSC和TA含量都沒有顯著差異，但貯藏結(jié)束后處理組B和C的VC含量顯著高于對照組（p＜0.05），說明采前噴施拮抗酵母能顯著延緩VC的下降。

表1 拮抗酵母采前噴施對采后草莓在貯藏前后的各品質(zhì)指標(biāo)的影響Table 1 Effects of preharvest C.laurentii treatment on quality parameters of strawberry fruits before and during 20℃storage

2.4 采前噴施拮抗酵母對草莓果皮顏色的影響

本實(shí)驗(yàn)通過測定L*、a*和H值來反映采前噴施拮抗酵母對草莓采后貯藏中的顏色變化影響。如表2所示，L*值代表果實(shí)的亮度，在采摘當(dāng)天各處理組之間L*值差異不顯著，經(jīng)過常溫貯藏4d后，各組的L值均下降但各處理之間差異較?。╬＞0.05）。a*值代表果實(shí)的紅度，貯藏結(jié)束后，各處理組a*值均有所增大，說明果皮顏色逐漸變紅，但各處理組之間沒顯著差異（p＞0.05）。各處理組的H值在貯藏前后均降低，說明果皮顏色變暗，但是各組之間差異不顯著（p＞0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采前噴施拮抗酵母對采摘當(dāng)天及貯藏期間草莓果皮的顏色變化基本沒有影響。

表2 拮抗酵母采前噴施對采后草莓在貯藏前后的顏色指標(biāo)的影響Table 2 Effects of preharvest C.laurentii treatment on color indexes of strawberry fruits before and during 20℃storage

2.5 拮抗酵母在草莓果實(shí)表皮生長動(dòng)態(tài)測定

同病原菌競爭營養(yǎng)物質(zhì)和生存空間是拮抗酵母控制采后果蔬病害的主要作用機(jī)理[20-21]，將拮抗酵母在果蔬采摘之前使用，可以使拮抗酵母在采摘之前于果蔬表面定殖生長，并布滿整個(gè)果蔬表面，有利于拮抗酵母在果蔬表面形成優(yōu)勢菌群，制造一個(gè)不利于病原微生物入侵的微生態(tài)系統(tǒng)[22]，從而有助于對果蔬采后貯藏期間病害的防治。

圖3顯示的是在采摘當(dāng)天和貯藏結(jié)束時(shí)不同處理組草莓果實(shí)表面酵母菌的數(shù)量。由于草莓果實(shí)在田間生長時(shí)在其表面會(huì)自然生長一些拮抗微生物，其中包括酵母類微生物，因此生長動(dòng)態(tài)測定實(shí)驗(yàn)中，對照CK組的虎紅瓊脂平板上也有酵母類拮抗微生物生長。在草莓果實(shí)采摘當(dāng)天，A、B、C三個(gè)處理組果實(shí)表面酵母菌的數(shù)量級分別是4、5、5，且三個(gè)處理之間差異顯著（p＜0.05）。此外，三個(gè)處理組草莓果皮表面定殖的酵母菌數(shù)量都明顯地大于CK組（p＜0.05）。

圖3 拮抗酵母在草莓果實(shí)表皮的生長動(dòng)態(tài)Fig.3 Population dynamics of C.laurentii on the surface of strawberry fruit

相比于采摘當(dāng)天，在貯藏期結(jié)束時(shí)，A、B二個(gè)處理組草莓果皮表面酵母菌的數(shù)量級上升，但都和采摘時(shí)處于同一數(shù)量級，但C處理組的酵母菌數(shù)量相比增加了一個(gè)數(shù)量級。同樣，A、B、C三個(gè)處理組草莓果皮定殖的酵母菌數(shù)量隨著采前拮抗酵母噴施次數(shù)的增多而增大的越多，且三個(gè)處理組之間也有顯著差異（p＜0.05），并且，CK組草莓果皮定殖的酵母菌數(shù)量明顯低于其他三個(gè)處理組（p＜0.05）。由圖3可以發(fā)現(xiàn)，在本實(shí)驗(yàn)條件下，拮抗酵母采前噴施次數(shù)越多，其在草莓果實(shí)表皮定殖的數(shù)量就越多，越有利于其形成優(yōu)勢菌群，越能夠發(fā)揮營養(yǎng)和空間的競爭作用來控制采后果蔬病害。

3 討論

許多病原菌的侵染往往發(fā)生在果蔬田間生長期間，而采前應(yīng)用拮抗酵母有利于拮抗菌先于病原菌定殖在果蔬表面，減少田間的潛伏性侵染和采摘及貯運(yùn)過程中傷口處病原菌的侵染。在實(shí)驗(yàn)中，選擇第一次噴施拮抗酵母的時(shí)間為采前6d，是因?yàn)榇藭r(shí)草莓果實(shí)處于轉(zhuǎn)色階段，容易受到病原菌的侵染。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明采前噴施拮抗酵母（C.laurentii）能減少草莓果實(shí)采后灰霉病和自然病害的發(fā)生，Tian等[14]研究也發(fā)現(xiàn)采前噴施濃度為108CFU/mL的拮抗酵母（C.laurentii）能減少甜櫻桃果實(shí)采后的病害。Larena等[23]認(rèn)為采前噴施Epicoccum igrum兩次以上才能減少桃果實(shí)采后的褐腐病。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果也表明采前噴施拮抗酵母的次數(shù)越多，其控制病害的效果也越好。

品質(zhì)參數(shù)是用來評價(jià)保鮮效果的一種重要指標(biāo)，許多研究表明使用天然殺菌劑能減少果蔬采后病害，還能較好地維持果蔬采后的品質(zhì)。Meng等[15]研究結(jié)果表明采前噴施拮抗酵母（C.laurentii）結(jié)合采后幾丁質(zhì)涂膜處理能減少葡萄在貯藏過程中的失重率。Castillo等[24]也發(fā)現(xiàn)采前應(yīng)用蘆薈汁液不僅能減少葡萄采后病害，還能降低果實(shí)的呼吸速率和失重率以及延緩果實(shí)色澤的加深和硬度的下降。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣證實(shí)，采前應(yīng)用拮抗酵母（C.laurentii）也能較好地維持草莓果實(shí)在貯藏過程中的品質(zhì)。在采摘之前6d+采摘之前3d+采摘當(dāng)天噴施拮抗酵母，能減少果實(shí)貯藏過程中的失重率，延緩硬度和VC的下降，但沒能延緩果實(shí)色澤變暗以及可溶性固形物含量和可滴定酸含量的降低。

果蔬采后腐爛往往是由于病原菌侵染傷口所引起的，采前應(yīng)用拮抗酵母有助于其更早地占領(lǐng)傷口位置，并快速消耗果實(shí)傷口處的營養(yǎng)使病原菌無法生長，從而在貯藏過程中能更持久的保護(hù)果蔬免受病原菌的侵染。采前噴施的時(shí)間和拮抗菌在果實(shí)表面的生長定殖能力對于其能否控制病害至關(guān)重要。研究發(fā)現(xiàn)采前噴施次數(shù)越多，拮抗酵母在草莓果實(shí)表面的定殖能力就越強(qiáng)。在采摘之前6d+采摘之前3d+采摘當(dāng)天噴施拮抗酵母，有利于其在果實(shí)表面定殖。采前應(yīng)用使拮抗酵母先于病原菌在果實(shí)表面生長定殖，并形成優(yōu)勢菌群，進(jìn)而發(fā)揮其營養(yǎng)和空間競爭作用來抑制病原菌的生長，這可能是采前應(yīng)用拮抗酵母控制果蔬采后病害的一個(gè)重要的機(jī)理。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)采前噴施拮抗酵母（C.laurentii）能有效地降低草莓果實(shí)采后灰霉病和自然病害導(dǎo)致的腐爛。隨著采前噴施次數(shù)的增加，果實(shí)貯藏過程中腐爛指數(shù)明顯降低，且C處理組（采前6d+采前3d+采摘當(dāng)天噴施拮抗酵母）控制果實(shí)采后腐爛的效果最好，常溫貯藏結(jié)束后果實(shí)的腐爛指數(shù)比對照組減少了68.31%。因此，拮抗酵母的采前應(yīng)用可以結(jié)合各果蔬果實(shí)的具體生長周期情況，適度的增加采前噴施次數(shù)，以防治果蔬采后貯藏期病害的侵染。

本實(shí)驗(yàn)中，采前噴施拮抗酵母（C.laurentii）還能較好的維持草莓采后常溫貯藏期間的品質(zhì)。采前噴施拮抗酵母能減少草莓果實(shí)的失重率，延緩硬度和VC的降低，但是對于草莓果實(shí)的顏色、可溶性固形物和可滴定酸含量無明顯影響。

拮抗酵母在果蔬表面的生長定殖能力對于其能否應(yīng)用于采前尤為重要。通過拮抗酵母（C.laurentii）在草莓果實(shí)表皮生長動(dòng)態(tài)測定可以發(fā)現(xiàn)：隨著采前噴施拮抗酵母的次數(shù)增多，其在果實(shí)表面的定殖數(shù)量也就增多，在采摘之前6d+采摘之前3d+采摘當(dāng)天噴施拮抗酵母，有利于其在草莓果實(shí)表面定殖。

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