牛奶中酵母β-葡聚糖的應用與測定

付俊鶴，望忠福，余明華，張 彥

（安琪酵母股份有限公司，湖北宜昌 443003）

酵母β-葡聚糖（見圖1）是酵母細胞壁的主要成分之一，分子量從幾萬到幾十萬不等[1]，分子主鏈以β-1，3糖苷鍵結合，支鏈以β-1，6糖苷鍵結合，這種獨特的三重超微螺旋結構是免疫活性最強、且最易被人體吸收的葡聚糖形式[2-3]。大量研究證明，酵母β-葡聚糖具有增強免疫功能[4-5]、抗輻射[6-7]與降血脂功能[8-9]。酵母β-葡聚糖已獲得美國FDA的GRAS（Generally Regarded As Safe）認證，中華人民共和國衛(wèi)生部也于2010年通過第9號公告，批準了酵母β-葡聚糖作為新資源食品，這使得酵母β-葡聚糖在食品行業(yè)有了更為廣泛的應用前景。目前酵母β-葡聚糖的測定方法多采用苯酚-硫酸法測定[10]，但該法精密度較差，并且不適合檢測牛奶中的酵母β-葡聚糖。本實驗在牛奶中添加了酵母β-葡聚糖，并對其含量進行測定，初步建立了牛奶中酵母β-葡聚糖的檢測方法，該法精密度較高，重復性良好，為酵母β-葡聚糖在乳制品中的應用提供了實驗基礎。

圖1 酵母β-1，3-D-葡聚糖分子結構Fig.1 Molecular structure of yeastβ-1，3-D-glucan

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮牛奶 宜昌喜旺食品有限公司；酵母β-葡聚糖 安琪酵母股份有限公司；葡萄糖 CAS：50-99-7，純度99.5%，Sigma公司，配制成0.2g/L標準溶液待用；半乳糖 CAS：59-23-4，純度99.5%，Sigma公司，配制成0.2g/L標準溶液待用；各種溶液 20%乙酸鋅溶液，10%亞鐵氰化鉀溶液，37%鹽酸溶液，40%氫氧化鈉溶液。

D-7000高效液相色譜儀 配有示差檢測器和糖柱，日本HITACHI公司；杜氏瓶 德國SCHOTT公司；BP221S電子天平 德國Sartorius公司；WH-2微型旋渦混合器 上海滬西分析儀器廠有限公司；BME100LII型實驗室高剪切乳化機 啟東市長江機電有限公司；YXQ.WY21.600臥式圓形壓力蒸汽滅菌鍋 上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司；Z326高速離心機 德國HERMLE公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 含酵母β-葡聚糖牛奶的制備 新鮮純牛奶→加熱至75～80℃→加入適量酵母β-葡聚糖→高速剪切10min→冷卻。

1.2.2 葡聚糖的測定原理 牛奶中的碳水化合物主要為乳糖，幾乎不含有其他的單糖或寡糖，在牛奶中，乳糖的含量約為3%。乳糖為一個半乳糖和一個葡萄糖結合的二糖，水解后分解為一個葡萄糖和一個半乳糖[11]，而乳制品中的葡聚糖在水解后生產葡萄糖[12]：

因此分別測定水解后樣品中葡萄糖和半乳糖含量，葡萄糖比半乳糖多出的部分，就是葡聚糖的含量。

1.2.3 樣品處理 精確稱取25.0000g（精確至0.0002g）樣品放入一個150mL離心管中，加入5mL 20%乙酸鋅溶液和5mL 10%亞鐵氰化鉀溶液，于7000r/min離心10min，去掉上清液，沉淀加25mL純水，振蕩混合均勻后，于7000r/min離心10min，去掉上清液，沉淀加25mL 75%乙醇，振蕩混合均勻后，于7000r/min離心10min，去掉上清液，沉淀再加25mL純水，振蕩混合均勻后，于7000r/min離心10min，去掉上清液，將沉淀轉入杜氏瓶中，分別加入6.0、9.0、12.0、18.0mL鹽酸（37%），加水至150mL，將瓶子放入高壓滅菌鍋121℃處理60min。完成后馬上冷卻，將溶液pH調到6～7，然后定容至200mL。使用0.45μm孔徑的醋酸纖維素膜過濾備用。

1.2.4 高效液相色譜條件 色譜柱：Sugar-Pak TM 1，6.5mm×300mm（美國Waters公司）；流動相：高純水；流速：0.5mL/min；柱溫：80℃；進樣量：20μL。待儀器基線平穩(wěn)后再進樣。

1.2.5 建立標準曲線方程 吸取葡萄糖標液1、3、5mL到10mL容量瓶中，用高純水定容到刻度，得到葡萄糖為20、60、100mg/L的混合標樣。在上述色譜條件下準確進樣20μL，得到色譜峰面積和標準物質量濃度之間的回歸方程。

采用同樣方法制定半乳糖標準曲線方程。

1.2.6 樣品分析 在同樣的色譜條件下，將處理好的樣品注入色譜儀中，記錄各色譜峰的保留時間和峰面積。用糖標樣色譜峰的保留時間定性，用糖標樣色譜峰的峰面積定量，計算出樣品中葡萄糖和半乳糖的質量濃度。

1.2.7 結果計算 參考文獻[13]，結果計算采用如下公式：

乳品中葡聚糖含量（%）=（C葡萄糖-C半乳糖）×V×0.9×F/W×100

式中：C葡萄糖：樣品水解定容后由HPLC測定得到了葡萄糖質量濃度，g/mL；C半乳糖：樣品水解定容后由HPLC測定得到了半乳糖質量濃度，g/mL；V：樣品水解后定容體積，mL；0.9：葡萄糖換算為葡聚糖的換算因子；F：葡聚糖水解校正因子，F=1.25；W：稱量的牛奶樣品質量，g。

2 結果與分析

2.1 葡萄糖與半乳糖的標準曲線方程

根據1.2.5的實驗方法，得到葡萄糖與半乳糖的標準曲線方程，結果如下：

葡萄糖的標準曲線方程：y=5191.8x+12876，R2=1

半乳糖的標準曲線方程：y=5772.1x+11656，R2=1

2.2 葡萄糖與半乳糖的HPLC色譜圖

圖2 葡萄糖與半乳糖的HPLC色譜圖Fig.2 HPLCchromatogram of glucose and galactose

樣品中葡萄糖與半乳糖的HPLC色譜圖見圖2，其中，葡萄糖的保留時間為9.37min，半乳糖的保留時間為10.31min。

2.3 不同濃度的水解用鹽酸對實驗結果的影響

為了考察使用不同鹽酸濃度水解時對實驗結果的影響，水解時，分別加入6.0、9.0、12.0、18.0mL鹽酸（37%），加水至150mL，使其濃度分別為0.5、0.75、1.0、1.5mol/L。每個濃度做兩個平行實驗。實驗結果見表1。

表1 不同濃度的水解用鹽酸對實驗結果的影響Table 1 Effect of hydrochloric acid at different concentrations for hydrolysis on the experimental results

實驗結果顯示，水解用鹽酸濃度選用1.0mol/L時，樣品水解較徹底，回收率大于80%，下一步將繼續(xù)在水解用鹽酸濃度1.0mol/L附近時開展大量重復實驗，進一步確定水解用鹽酸濃度。

2.4 水解用鹽酸濃度的進一步確定

前期實驗了0.5、0.75、1.0、1.5mol/L的鹽酸濃度，初步發(fā)現：使用1.0mol/L的鹽酸水解樣品能獲得較好的回收率。為了進一步確定水解用鹽酸濃度，現開展如下細化實驗：取同一批添加了酵母β-葡聚糖的牛奶，分別使用0.8、0.9、1.0、1.1、1.2mol/L的鹽酸水解樣品，每個樣品做若干個平行。實驗數據見表2。

表2 水解用鹽酸濃度的進一步確定Table 2 Further determination of the hydrochloric acid concentration for hydrolysis

實驗結果表明，水解用鹽酸濃度使用1.0～1.2mol/L時，結果較好，鹽酸濃度選用1.0mol/L最佳。

2.5 精密度實驗

取適量酵母β-葡聚糖含量為0.06%的牛奶，水解用鹽酸濃度為1.0mol/L，根據上述檢測方法，重復檢測5次，結果見表3。

表3 精密度實驗Table 3 Precision test

實驗結果顯示，當水解用鹽酸濃度為1.0mol/L時，測定結果的RSD值為4.64%，測定結果穩(wěn)定性良好。

2.6 回收率實驗

依據上述實驗確定的最佳酸體系（1.0mol/L鹽酸），取同一批牛奶（酵母β-葡聚糖含量為0.06%）作為基礎樣品進行回收率實驗。牛奶中酵母β-葡聚糖添加量分別為0.06%的80%、100%、120%，即0.048%、0.06%、0.072%。每個添加量重復三次實驗，結果見表4。

回收率實驗結果顯示，當水解用鹽酸濃度為1.0mol/L時，平均回收率在96.39%～97.22%之間，測定結果的RSD值在2.51%～5.38%之間，測定結果穩(wěn)定性良好。

表4 回收率實驗Table 4 Recovery test

3 結論

本實驗對牛奶中的酵母β-葡聚糖進行高溫水解-HPLC檢測，確定水解用鹽酸的濃度選用1.0mol/L較為適宜；該測定方法的穩(wěn)定性良好，回收率較高。該檢測方法的建立，為酵母β-葡聚糖在奶制品中的應用提供了實驗基礎。下一步將繼續(xù)探討鹽酸水解時間、水解溫度等因素對測定結果的影響。

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