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    斑點叉尾鮰魚皮膠原蛋白的理化特征研究

    2013-12-06 07:13:30喻亞麗周運濤
    食品工業(yè)科技 2013年4期
    關(guān)鍵詞:羥脯氨酸魚皮溶性

    喻亞麗,周運濤,何 力,呂 磊,龐 昆

    (1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院,湖北武漢 430070;2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所,湖北武漢430223;3.中國水產(chǎn)科學(xué)院淡水漁業(yè)研究中心,江蘇無錫214081)

    膠原蛋白是動物體內(nèi)含量最多、分布最廣的蛋白質(zhì),是由三條肽鏈螺旋形成的纖維狀蛋白,是細胞外基質(zhì)的主要成分[1]。目前已知的超過28種膠原蛋白,多富含于動物的皮膚、骨骼、軟骨、肌腱、韌帶、血管、角膜中[2],而動物皮膚是膠原蛋白的主要原料來源。I型膠原蛋白由于其特殊的三螺旋結(jié)構(gòu),具有低抗原性、很好的生物相容性和生物降解性。因此,膠原蛋白在化妝品、生物制藥、組織材料、生物醫(yī)學(xué)材料中有著廣泛應(yīng)用[3]。膠原蛋白普遍存在于動物體內(nèi),在選用膠原原料來源時,要綜合考慮其效能性及安全性。同哺乳動物來源的膠原蛋白相比,水生生物沒有疾病傳播和飲食的限制,所以人們對其來源的膠原蛋白產(chǎn)生了很大的興趣[4]。有研究表明,硬骨魚魚皮原料具有一定的特殊性,如皮料的韌性和交聯(lián)程度較低,所以魚皮膠原蛋白遠比豬皮、牛皮的膠原蛋白易于提取[5]。選用魚類加工中產(chǎn)生的下腳料作為膠原蛋白提取原料,不僅能降低成本、得到更大的附加值,還具備很高的安全性。斑點叉尾鮰(Ictalurus punctatus),又名溝鯰、鉗魚,原產(chǎn)自北美,后在我國廣泛的引種養(yǎng)殖。在我國水產(chǎn)品養(yǎng)殖中占有重要的份量,2010年養(yǎng)殖產(chǎn)量達到21萬t。作為水產(chǎn)品貿(mào)易中主要的出口品種,斑點叉尾鮰一般加工成魚片出口國外,在此過程中產(chǎn)生大量的下腳料。近幾年魚皮的價值被重視,充分利用魚皮資源、開發(fā)魚皮制品,已經(jīng)成為淡水魚下腳料綜合利用的重要方面。本研究提取得到了斑點叉尾鮰魚皮中的酸溶性膠原蛋白(ASC)和酶溶性膠原蛋白(PSC),同時進行理化性質(zhì)的分析和比較研究,為進一步開發(fā)膠原蛋白的應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與設(shè)備

    斑點叉尾鮰 武漢華南水產(chǎn)品批發(fā)市場;標(biāo)準(zhǔn)I型膠原蛋白、胃蛋白酶(活性3000U/mg) 博美公司;L-羥脯氨酸 索萊寶公司;蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量標(biāo)準(zhǔn)(高) TaKaRa公司;乙酸、HCl、NaCl、AgNO3等試劑 均為分析純;實驗所用水 均為超純水。

    恒溫磁力加熱攪拌器 江蘇金壇市億通電子有限公司;UV-2802PC型紫外分光光度計 尤尼柯(上海)儀器有限公司;Spetrum 100型傅里葉紅外光譜儀 珀金埃爾默儀器有限公司;CR-21型高速冷凍離心機 HITACHI公司;DYY-6C型電泳儀 北京六一儀器廠;Alpha 1-4 LST型冷凍干燥機 德國CHRIST公司;DSC 821e型差式掃描量熱儀 瑞士梅特勒公司。

    1.2 實驗方法

    1.2.1 魚皮膠原蛋白的提取

    1.2.1.1 魚皮前處理 用自來水沖洗斑點叉尾鮰,在冰上剝下魚皮,剔除皮下結(jié)締組織和脂肪組織。將魚皮用蒸餾水沖洗干凈,剪成0.5cm×0.5cm大小塊狀,保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

    取一定量魚皮,先用蒸餾水沖洗三次,除去魚皮上殘留的雜質(zhì)。4℃下,以料液比1∶10(W/V)加入0.1mol/L的NaOH攪拌5h,除去魚皮中非膠原蛋白和色素,然后冰水沖洗魚皮至中性。加入10%正丁醇(W/V=1∶30),靜置24h,以去除脂肪,冰水沖洗魚皮至中性。

    1.2.1.2 酸溶性膠原蛋白(ASC)提取 參考文獻[6]的方法,并進行改進。取經(jīng)過前處理的魚皮,加入0.5mol/L的乙酸(W/V=1∶40),4℃低速攪拌24h。24h后,在5000r/min離心10min,取上清液,將未提取徹底的魚皮再次用等量的0.5mol/L乙酸提取。用乙酸提取三次后,混合上清液,加入一定量氯化鈉攪拌,至最終鹽濃度為0.9mol/L。靜置過夜,5000r/min離心10min后棄上清液。再將沉淀溶于0.5mol/L乙酸,8000r/min離心20min除去不溶性雜質(zhì)。經(jīng)三次鹽析后,將沉淀溶解于0.1%乙酸溶液中,用三蒸水進行透析,直至用10g/L AgNO3檢測不到Cl-為止,然后對透析過的膠原蛋白溶液進行冷凍干燥,得到酸溶性膠原蛋白。

    1.2.1.3 酶溶性膠原蛋白(PSC)提取 將1.2.1.1前處理過的魚皮,加入0.5mol/L的乙酸(W/V=1∶40)和0.1%(M/V)胃蛋白酶,4℃低速攪拌24h。5000r/min離心10min,取上清液。依次進行鹽析、透析、冷凍干燥得到酶溶性膠原蛋白。

    1.2.2 膠原蛋白純度的測定 參考文獻[7]的方法,并進行改進。稱取一定量的膠原蛋白,加入6mol/L HCl(W/V=1∶100),于110℃水解24h。取1mL水解液,采用對二甲基氨基比色法[8]測定樣品液中羥脯氨酸含量,將羥脯氨酸含量乘以換算系數(shù),即得到實際提取得到的純膠原蛋白的含量。按下式計算膠原蛋白純度:

    式中:C為羥脯氨酸質(zhì)量濃度(μg/mL);m為樣品質(zhì)量(g);F為11.1換算系數(shù)。

    1.2.3 紫外吸收光譜分析 參考郭恒斌等[9]的方法,將一定量的斑點叉尾鮰魚皮膠原蛋白溶于0.5mol/L的乙酸中,配制成0.05%的膠原乙酸溶液,以0.5mol/L的乙酸作為空白對照。室溫下,使用紫外分光光度計,在190~400nm近紫外光區(qū)進行掃描。

    1.2.4 傅里葉紅外光譜分析 在干燥的條件下,取凍干的膠原蛋白樣品1mg,經(jīng)KBr壓片,用Spetrum 100紅外光譜儀對樣品進行紅外掃描。掃描范圍為4000~550cm-1,掃描次數(shù)為32次。

    1.2.5 SDS-PAGE電泳測定 參考Laemmli[10]SDSPAGE電泳方法分析膠原蛋白樣品,分離膠濃度7.5%、濃縮膠濃度5%。將提取的凍干膠原蛋白,配制成2mg/mL的膠原蛋白溶液。以1∶1的比例,取7.5μL膠原蛋白溶液分別加入7.5μL含有10%(V∶V)β-巰基乙醇的2×樣品處理液(將SDS、甘油、溴酚藍溶于0.5mol/L Tris-HCl緩沖液中)和7.5μL未加β-巰基乙醇的2×樣品處理液配成1mg/mL的溶液,100℃煮沸5min。電泳上樣15μL,直流穩(wěn)壓,蛋白樣品在濃縮膠中時的電壓為100V,進入分離膠后調(diào)至160V。電泳結(jié)束后,將凝膠放入0.2%考馬斯亮藍染液(水∶95%乙醇∶冰醋酸=5∶4∶1,V∶V∶V)進行染色1h;然后在脫色液(醫(yī)用酒精∶冰醋酸∶水=9∶1∶10,V∶V∶V)中脫色24h,至背景清晰。

    1.2.6 熱變性溫度的測定 使用差式掃描儀測定樣品的變性溫度。取一定量的冷凍干燥的膠原蛋白以1∶40的料液比,加入0.05mol/L醋酸,使之水化(膠原蛋白水化物變性溫度分析時,最多可以在4℃保存2d)。取5~10mg樣品放于坩堝中,平鋪,加蓋密封,以空坩堝作為對照,掃描溫度范圍為20~50℃,升溫速率為1℃/min,樣品室氮氣流量為20mL/min。DSC譜圖中峰值對應(yīng)的橫坐標(biāo)即為膠原蛋白的熱變性溫度。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 膠原蛋白的純度測定

    膠原蛋白提取過程中,酸性條件會破壞膠原分子間的鹽鍵和Schiff鍵,引起膠原纖維膨脹、溶解,后通過鹽析的方法能夠提取得到粗膠原蛋白。由于膠原蛋白分子內(nèi)和分子間有緊密的交聯(lián),延長酸提取的時間可以提高膠原蛋白的溶解量。Elzbieta Skierka[11]的研究中,使用乙酸、乳酸和鹽酸進行魚皮膠原蛋白的提取,發(fā)現(xiàn)0.5mol/L乙酸的提取膠原蛋白量較高。本實驗中,酸溶性膠原蛋白提取時,每次24h分3次乙酸對斑點叉尾鮰魚皮進行提取,魚皮能夠全部溶解,得到較高產(chǎn)率的酸溶性膠原蛋白。酶溶性膠原蛋白提取時,由于胃蛋白酶催化水解膠原蛋白的端肽,降低了膠原蛋白分子內(nèi)部的交聯(lián),在酸性條件下24h即可完全溶解得到具有完整三螺旋結(jié)構(gòu)的酶溶性膠原蛋白。提取過程中,魚皮上的色素也大量溶解于乙酸中,通過多次鹽析和提高轉(zhuǎn)速的方法,能夠?qū)⑸睾碗s質(zhì)去除,得到純度較高的膠原蛋白。

    按1.2.2方法測定羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)樣品的吸光度,得其回歸方程為:A=0.0679C+0.0003,相關(guān)系數(shù)R2=0.9996(A代表吸光值,C代表羥脯氨酸濃度)。按回歸方程計算得ASC和PSC羥脯氨酸質(zhì)量濃度為分別為1.677、1.684μg/mL,計算得ASC純度為93.11%,PSC純度為93.46%。提取得到的ASC和PSC純度均高于周愛梅等[12]提取的羅非魚皮Ⅰ型膠原蛋白純度的84.61%,而低于林琳[13]提取的鱈魚皮和魷魚皮膠原蛋白純度的98%。不同的研究中,提取得到的膠原蛋白的純度具有一定的差異性,這可能是由于提取方法中料液比、提取溫度、原料等因素的不同造成的。本實驗中提取的膠原蛋白的純度較高,該結(jié)果在紫外吸收光譜分析和SDS-PAGE結(jié)果中得到驗證。

    圖1 羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of hydroxyproline

    2.2 ASC、PSC紫外吸收光譜

    圖2為標(biāo)準(zhǔn)I型膠原蛋白的紫外吸收光譜,吸收峰在234nm處;圖3為提取得到的ASC和PSC掃描獲得的紫外吸收光譜,紫外吸收波峰均在233nm處。斑點叉尾鮰魚皮膠原蛋白的吸收峰位置和標(biāo)準(zhǔn)I型膠原蛋白相近,初步判斷符合I型膠原蛋白的特征[14]。

    圖2 標(biāo)準(zhǔn)I型膠原蛋白紫外吸收光譜Fig.2 UV spectrum of collagen type I

    圖3 斑點叉尾鮰魚皮ASC和PSC紫外吸收光譜圖Fig.3 UV spectrum of ASC and PSC from channel catfish skin

    不同于一般的蛋白質(zhì),膠原蛋白組成中由于只含有少量芳香族氨基酸,在280nm處基本無吸收,而膠原肽鏈所含的C=O、-COOH、CONH2都是生色基團,可在220nm附近產(chǎn)生較強的紫外吸收[15]。提取得到的膠原蛋白在280nm處只有很弱的吸收,說明芳香族氨基酸含量很低。同時,也表明通過該方法提取得到的膠原蛋白雜蛋白含量少,純度很高。段宙位等[7]研究的羅非魚尾膠原蛋白的紫外最大吸收峰為232.35nm,辛菲等[16]研究的鲅魚皮酸溶性膠原蛋白的最大吸收峰為227nm,均與本實驗結(jié)果一致。由于膠原蛋白來源不同,從而氨基酸種類和含量的差異,使膠原肽鏈所含的生色基團有所不同,從而導(dǎo)致不同來源的膠原蛋白紫外吸收波峰存在一定的不同。

    2.3 ASC、PSC傅里葉紅外光譜

    由圖4和表1可知,斑點叉尾鮰魚皮酸溶性和酶溶性膠原蛋白的吸收波峰具有一定的相似性。ASC和PSC的酰胺A分別在3301cm-1和3313cm-1處,該條帶的出現(xiàn)與N-H伸縮振動有關(guān),也表明了氫鍵的存在。Doyle等[17]的研究表明,自由的N-H伸縮振動一般在3400~3440cm-1處,當(dāng)肽鍵中的N-H基團包含在氫鍵中時,其振動的波數(shù)會下降。酰胺B出現(xiàn)于2927cm-1和2948cm-1,這是膠原蛋白常出現(xiàn)的波數(shù),同Phanat Kittiphattanabawon[18]研究的結(jié)果一致。

    圖4 ASC和PSC傅里葉紅外吸收光譜Fig.4 FTIR spectra of ASC and PSC from skin of channel catfish skin

    表1 斑點叉尾鮰魚皮ASC和PSC紅外光譜特征吸收峰的位置及說明Table 1 Fourier transform infrared spectroscopy spectra peaklocations and assignment of ASC and PSC from channel catfish skin

    ASC和PSC的酰胺I出現(xiàn)在1638cm-1和1642cm-1處,表示了C=O的伸縮振動,該條帶和蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)有關(guān)。這兩種膠原蛋白的酰胺Ⅱ出現(xiàn)在1545cm-1和1543cm-1處,這是由N-H的彎曲振動和C-N的伸縮振動引起的。同時,ASC和PSC的酰胺Ⅲ均在1235cm-1處,該波數(shù)同1454cm-1的比值大約為1,表明了三級螺旋結(jié)構(gòu)的存在[19]。ASC和PSC的紅外吸收結(jié)果部分有所不同,這可能是由胃蛋白酶剪切掉的非螺旋區(qū)域引起的。因此,F(xiàn)TIR說明了斑點叉尾鮰魚皮ASC和PSC具有特殊的三級螺旋結(jié)構(gòu)和相似的二級結(jié)構(gòu)。斑點叉尾鮰魚皮膠原蛋白的傅里葉紅外圖譜同易繼兵[6]從獅子魚皮中提取的膠原蛋白的紅外圖譜相似,但吸收波峰略有不同,這可能是由于原料的不同、提取的膠原蛋白中所含的色素雜質(zhì)等因素造成,也有可能是在魚皮膠原蛋白在提取過程中有少部分結(jié)構(gòu)發(fā)生變化所致。

    2.4 電泳分析

    圖5電泳圖中,ASC和PSC是由α1和α2組成,其中從光密度來看α1和α2的比率為2∶1,因此膠原蛋白的組成應(yīng)該為(α1)2α2。這種結(jié)構(gòu)符合已知報道的真骨魚膠原含有兩條[20-21]或者三條[22]不同的鏈,斑點叉尾鮰魚皮膠原蛋白的電泳圖譜同Prabjeet Singh[3]研究的條紋鯰魚魚皮的膠原蛋白的電泳圖譜相似,可以確定其為I型膠原蛋白。

    電泳圖5中β為兩條肽鏈的二聚體,γ為三條肽鏈螺旋在一起的三聚體。ASC的β、γ鏈亮度強于PSC,而α弱于PSC,表明ASC的分子內(nèi)和分子間的交聯(lián)高于PSC[23]。這證明了在低溫條件下,胃蛋白酶可以切掉膠原的端肽,從而使膠原分子在電泳的前處理階段更容易以肽鏈的形式出現(xiàn),大部分解旋為α鏈。ASC和PSC的α鏈的電泳遷移率相近,表明胃蛋白酶的切割位點靠近原膠原蛋白的非螺旋末端。β、γ鏈含量較高,也可以充分說明低溫下,乙酸法提取和乙酸-胃蛋白酶提取方法均可以較好的保持膠原蛋白的結(jié)構(gòu)完整性。比較ASC和PSC的電泳圖譜,兩種樣品的電泳圖一致,是否添加β-巰基乙醇對膠原蛋白的肽鏈無影響。說明在ASC和PSC在三螺旋區(qū)缺乏二硫鍵,這與膠原蛋白氨基酸組成中缺乏半胱氨酸的結(jié)論是一致的。

    圖5ASC和PSC SDS-PAGE圖Fig.5 SDS-PAGE patterns of ASC and PSC fromchannel catfish skin

    2.5 變性溫度測定

    斑點叉尾鮰魚皮膠原蛋白的變性溫度見圖6。其中ASC的變性溫度為34.2℃,PSC為33.9℃。斑點叉尾鮰魚皮膠原蛋白的變性溫度高于虹色金線魚的33.35℃[2],低于曹軍魚ASC的38.17℃和PSC的36.03℃[24],接近于草魚皮ASC的33.8℃和PSC的34.5℃[25]。不同來源膠原蛋白的變性溫度是由其亞氨基酸、體溫和環(huán)境溫度共同決定的[26]。一般冷水性魚類的膠原蛋白的羥脯氨酸的含量比暖水性魚類高,同時熱變性溫度也較低[27]。本實驗中斑點叉尾鮰魚皮膠原蛋白的變性溫度也同該結(jié)論相一致。PSC的主要結(jié)構(gòu)是肽鏈的三螺旋結(jié)構(gòu),而在ASC中除了包含三螺旋結(jié)構(gòu)還包含有部分非螺旋的肽鏈[28]。斑點叉尾鮰魚皮膠原蛋白變性溫度測定中,PSC熱焓值(△H=0.8759J/g)遠遠高于ASC(△H=0.1855J/g)。這可能是由于胃蛋白酶的處理切除了PSC末端的肽鏈,需要更多的能量來使PSC的結(jié)構(gòu)更加有序,所以熱焓值也高于ASC。

    圖6ASC和PSC的DSC溫度曲線圖Fig.6 DSC thermogram of ASC and PSC fromchannel catfish skin

    3 結(jié)論

    本研究中,低溫條件下,使用乙酸溶液提取和胃蛋白酶提取的方法,從斑點叉尾鮰魚皮中提取膠原蛋白并對其理化特性進行分析。

    傅里葉紅外測定表明,ASC和PSC均在1235cm-1處具有吸收峰,表明其具有完整的三螺旋結(jié)構(gòu)。研究表明膠原蛋白具有低免疫原性,而其免疫原性部分來自于端肽。由于胃蛋白酶催化水解了膠原的端肽非螺旋區(qū),而對螺旋區(qū)無作用,這樣溶解的膠原仍具有完整的三螺旋結(jié)構(gòu),更降低了膠原的抗原性,具有良好的生物相容性[1]。酶溶性膠原蛋白在生物醫(yī)用材料、制藥和功能食品等方面具有更好的應(yīng)用潛能。但是對應(yīng)用于組織工程領(lǐng)域的膠原材料,則應(yīng)保留其端肽,目的是保存其交聯(lián)位點,賦予組織材料所需的完整結(jié)構(gòu)。因此,將ASC和PSC的理化性質(zhì)進行分析,膠原蛋白生物相容性方面的研究提供一定的理論基礎(chǔ)。

    目前,在食品工業(yè)中水產(chǎn)膠原蛋白應(yīng)用較多的是魚皮膠原蛋白,利用魚皮膠原蛋白可以生產(chǎn)新型的膠原多肽、氨基酸口服液、膠原蛋白飲料等。由于斑點叉尾鮰生長環(huán)境溫度和魚皮氨基酸組成的影響,使其變性溫度低于豬、牛等哺乳動物膠原蛋白的變性溫度,導(dǎo)致其應(yīng)用受到一定的限制。Sionkowska[29]研究表明較短時間的紫外照射可以使膠原分子之間形成更多的交聯(lián)結(jié)構(gòu),提高其熱變性溫度。任俊莉等[30]研究發(fā)現(xiàn)使用戊二醛對膠原蛋白進行交聯(lián)處理,可使其熱穩(wěn)定性提高。因此,采用一定的物理化學(xué)方法對膠原蛋白進行處理,可以提高其熱穩(wěn)定性,使其在食品包裝、食品添加劑等方面有更廣泛的應(yīng)用。

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