全反式維甲酸抑制IL-23/IL-17通路促進(jìn)小鼠移植皮膚存活的研究*

徐三榮 周 慶 韓 博 李 偉

近年來研究發(fā)現(xiàn)機(jī)體的免疫系統(tǒng)中存在著一種新的CD4+T細(xì)胞亞群，以高水平分泌白細(xì)胞介素（IL）-17，并表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子孤核受體（ROR）γt為主要特征，被命名為Th17細(xì)胞[1]。已證實(shí)，Th17細(xì)胞在自身免疫性疾病和移植排斥反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要的作用，其分化和功能受IL-23的調(diào)控[2-3]。全反式維甲酸（ATRA）是維生素A的一種活性代謝產(chǎn)物，在抑制Th17細(xì)胞的分化和擴(kuò)增中發(fā)揮重要的作用[4]。本研究以小鼠皮膚移植為模型，探討ATRA對IL-23和IL-17表達(dá)的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。近交系、SPF級雄性Balb/c(H-2d)小鼠60只和DBA/2(H-2d)小鼠15只，6～8周齡，體質(zhì)量18～22 g，購于中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)于江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，自由攝食和飲水。（2）主要試劑及儀器。iCycler iQ實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（Real-time PCR）儀、GelDoc1000凝膠成像系統(tǒng)（美國BioRad公司），ATRA（美國Sigma公司），總RNA提取試劑Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和Real-time PCR反應(yīng)試劑盒（日本Ta?KaRa公司），IL-23和IL-17定量酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 以DBA/2小鼠為供者，Balb/c小鼠為受者，進(jìn)行背-背部皮膚移植。受者小鼠隨機(jī)分為對照組、小劑量組、大劑量組共3組，每組20只，術(shù)后5 d每組處死10只用于皮膚移植物和血液標(biāo)本收集及檢測，另外10只用于術(shù)后生存分析。于移植前1 d至術(shù)后14 d或判定移植皮膚死亡之日，對照組每天以玉米油（0.25 mL）灌胃；小劑量組、大劑量組每天分別給予ATRA 10、30 mg/kg（溶解于玉米油）灌胃。

1.2.2 皮膚移植 取DBA/2供者小鼠，腹腔注射5 g/L的戊巴比妥鈉麻醉，備皮、消毒后取直徑約1 cm的圓形背側(cè)全厚皮膚，刮除皮下脂肪及血管等組織，放于無菌生理鹽水中備用。Balb/c受者小鼠麻醉、備皮、消毒后，剪去左側(cè)胸腹交界處直徑約1 cm圓形皮膚。將供者皮膚覆蓋于受者創(chuàng)面上，用4-0絲線間斷縫合，醫(yī)用創(chuàng)可貼稍加壓包扎固定，5 d后去除敷料，以后觀察皮膚存活情況。50%以上結(jié)痂、壞死、變硬或脫落視為皮膚死亡。

1.2.3 樣本的收集與制備 移植術(shù)后5 d，每組分別取10只小鼠，頸椎脫臼法處死，留取血液和皮膚移植物樣本。血液于室溫下靜置1 h，待其凝固，1 500×g離心10 min，吸取上清，-80℃下保存待用。皮膚組織部分浸泡于4%中性甲醛溶液用于病理切片，部分放入液氮中，并移至-80℃冰箱備用。

1.2.4 檢測方法 （1）HE染色檢測皮膚移植物。取中性甲醛固定后的皮膚移植物，常規(guī)石蠟切片，HE染色，光鏡下觀察。（2）ELISA測定血清IL-23、IL-17水平。室溫下充分解凍血清樣本，按試劑盒說明書操作，每個(gè)樣品均設(shè)2個(gè)復(fù)孔。反應(yīng)終止后，用Biotek酶標(biāo)儀檢測450 nm光密度（OD）值。用Curve Expert 1.3軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣本OD值對應(yīng)的濃度。（3）Real-time PCR檢測皮膚移植物IL-23、RORγt和IL-17 mRNA表達(dá)。參照GenBank序列，應(yīng)用Primer Express 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物序列見表1，由上海生工生物工程有限公司合成。采用三步法PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序，反應(yīng)體系30 μL，預(yù)變性94℃5 min，PCR反應(yīng)94℃ 20 s，53℃ 30 s，72℃30 s，40個(gè)循環(huán)。根據(jù)動(dòng)力學(xué)曲線確定各樣品管中熒光強(qiáng)度增加到某一特定閾值時(shí)的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)（Ct值）。以目的基因與內(nèi)參基因（β-actin）Ct值的差值（△Ct）表示基因的相對表達(dá)水平，△Ct值越大，mRNA的相對表達(dá)水平越低。

Table 1 Primer sequences表1 引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±ss)表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用q檢驗(yàn)，存活時(shí)間比較應(yīng)用Log-Rank法，相關(guān)性分析采用Pearson直線相關(guān)，Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組皮膚移植物存活時(shí)間 對照組、小劑量組和大劑量組皮膚移植物中位存活期分別為13、16、15.5 d，小劑量組、大劑量組高于對照組(χ2分別為16.900、9.915，均Plt;0.01)，而小劑量組、大劑量組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.054，P=0.817)，見圖1。

Figure 1 Survival curves of skin grafts in three group圖1 各組皮膚移植物的生存曲線

2.2 各組皮膚移植物組織學(xué)觀察 移植術(shù)后5 d，HE染色顯示對照組皮膚有少量的淋巴細(xì)胞浸潤，皮膚組織結(jié)構(gòu)分離，分級為Ⅱ級；而小劑量組和大劑量組可見散在的淋巴細(xì)胞浸潤，皮膚層次結(jié)構(gòu)及附屬器形態(tài)完整，分級均為Ⅰ級，見圖2。

Figure 2 The histological examination of skin grafts on 5 days after transplantation(HE,×200)圖2 皮膚移植術(shù)后5 d組織病理學(xué)檢查（HE,×200）

2.3 各組小鼠血清中IL-23、IL-17水平 皮膚移植術(shù)后5 d，小劑量組和大劑量組血清IL-23水平較對照組降低（Plt;0.05），而前2組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；對照組、小劑量組及大劑量組血清IL-17水平依次降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05），見表2。3組受者血清IL-23水平與IL-17水平呈正相關(guān)（r=0.712，Plt;0.01）。

Table 2 Comparison of serum levels of IL-23 and IL-17 between three groups表2 各組血清中IL-23、IL-17水平比較（n=10，ng/L，x±s）

2.4 各組受者皮膚移植物IL-23、RORγt和IL-17 mRNA表達(dá)水平 皮膚移植術(shù)后5 d，小劑量組、大劑量組IL-23、RORγt和IL-17 mRNA的表達(dá)水平均低于對照組（Plt;0.05），而大、小劑量組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表3。3組小鼠皮膚移植物IL-23與IL-17基因表達(dá)水平呈正相關(guān)（r=0.515，Plt;0.05），RORγt與IL-23、IL-17基因表達(dá)水平亦呈正相關(guān)（r分別為0.430、0.417，均Plt;0.05）。

Table 3 Relative expression levels of IL-23,RORγt and IL-17 mRNA in skin grafts between three groups表3 3組皮膚移植物中IL-23、RORγt和IL-17 mRNA相對表達(dá)水平（n=10，△CT，x±s）

3 討論

傳統(tǒng)認(rèn)為Th1/Th2途徑是移植排斥反應(yīng)發(fā)生的主要機(jī)制。而近來研究表明，Th17細(xì)胞也參與了急性排斥反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展[5]，其主要效應(yīng)因子是IL-17，IL-17具有強(qiáng)大的致炎性，主要是通過刺激基質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-6、IL-8、腫瘤壞死因子（TNF）-α和IL-1β等促炎細(xì)胞因子，介導(dǎo)中性粒細(xì)胞在急性炎癥部位聚集，從而誘導(dǎo)前炎癥反應(yīng)[6]。Gorbacheva等[7]通過將A/J小鼠心臟移植給IL-17基因敲除的Balb/c小鼠，研究表明IL-17在移植早期具有趨化效應(yīng)性T細(xì)胞到移植物中的作用，從而加大了移植炎癥反應(yīng)及組織損傷。而應(yīng)用IL-17R:IgG-Fc中和IL-17能使T細(xì)胞對異型抗原的增生反應(yīng)受到抑制，明顯減輕移植物的排異反應(yīng)[8]。IL-23是維持Th17細(xì)胞增殖和存活的重要細(xì)胞因子，屬于IL-12細(xì)胞因子超家族，是由IL-23p19亞基和IL-12p40亞基組成的異二聚體，主要由活化的抗原遞呈細(xì)胞分泌產(chǎn)生[9]。早期研究表明IL-23在Th17細(xì)胞的增殖分化過程中起重要作用，但隨后的研究證實(shí)初始T細(xì)胞不表達(dá)IL-23R，因此，有研究認(rèn)為IL-23在初始T細(xì)胞向Th17分化早期不能發(fā)揮作用，但I(xiàn)L-23對Th17細(xì)胞后期的增殖存活以及功能的維持具有促進(jìn)作用[10-11]。熊俊杰等[12]在大鼠胰島移植中將IL-23R抗體注射到大鼠體內(nèi)阻斷IL-23R，有效降低了IL-17的表達(dá)，且其抑制作用為劑量依賴性，表明IL-23對IL-17表達(dá)的促進(jìn)作用可以被IL-23R抗體抑制。ATRA目前被廣泛用于角化異常性皮膚病及急性早幼粒細(xì)胞白血病的治療，其生物學(xué)效應(yīng)主要是通過核內(nèi)維甲酸受體（RAR）和維甲酸X受體（RXR）來介導(dǎo)。近年來有報(bào)道ATRA通過與RAR結(jié)合下調(diào)維甲酸相關(guān)RORγt的表達(dá)而抑制Th17細(xì)胞的分化[13]，及通過減少IL-6R、IL-23R的表達(dá)而抑制Th17細(xì)胞的功能[4]。

本研究以主要組織相容性復(fù)合體（MHC）相同而次要淋巴細(xì)胞刺激抗原（MLS）不同的DBA（H-2d）與Balb/c（H-2d）小鼠建立皮膚移植模型，結(jié)果表明ATRA有效延緩皮膚移植排斥反應(yīng)的機(jī)制可能與降低IL-23、RORγt和IL-17的mRNA表達(dá)，從而抑制IL-23與IL-17的分泌有關(guān)。相關(guān)性分析表明IL-23對IL-17的分泌可能有促進(jìn)作用，而其作用可以被ATRA阻斷。雖然隨著ATRA劑量的增大，對IL-17蛋白分泌的抑制作用也顯著增強(qiáng)，且皮膚移植物存活時(shí)間并沒有相應(yīng)的延長，可能原因是ATRA對抗炎癥反應(yīng)復(fù)雜，并不僅僅依賴對Th17細(xì)胞的抑制，而是Th1/Th17、Th1/Th2和Tregs/Th17平衡等機(jī)制共同作用的結(jié)果，在以后的研究中將進(jìn)一步探討其機(jī)制。

[1]Park H,Li Z,Yang XO,et al.A distinct lineage of CD4 T cells regu?lates tissue inflammation by producing interleukin 17[J].Nat Immu?nol,2005,6(11):1133-1141.

[2]Lyakh L,Trinchieri G,Provezza L,et al.Regulation of interleukin-12/interleukin-23 production and the T-helper 17 response in humans[J].Immunol Rev,2008,226:112-131.

[3]Liu XC,Zhai A,Li JQ,et al.Interleukin-23 promotes natural killer T-cell production of IL-17 during rat liver transplantation[J].Trans?plant Proc,2011,43(5):1962-1966.

[4]Xiao S,Jin H,Korn T,et al.Retinoic acid increases Foxp3+regula?tory T cells and inhibits development of Th17 cells by enhancing TGF-beta-driven Smad3 signaling and inhibiting IL-6 and IL-23 receptor expression[J].J Immunol,2008,181(4):2277-2284.

[5]Afzali B,Lombardi G,Lechler RI,et al.The role of T helper 17(Th17)and regulatory T cells(Treg)in human organ transplantation and au?toimmune disease[J].Clin Exp Immunol,2007,148(1):32-46.

[6]Jovanovic DV,Di Battista JA,Martel-Pelletier J,et al.IL-17 stimu?lates the production and expression of proinflammatory cytokines,IL-beta and TNF-alpha,by human macrophages[J].J Immunol,1998,160(7):3513-3521.

[7]Gorbacheva V,Fan R,Li X,et al.Interleukin-17 promotes early al?lograft inflammation[J].Am J Pathol,2010,177(3):1265-1273.

[8]Antonysamy MA,Fanslow WC,Fu F,et al.Evidence for a role of IL-17 in alloimmunity:a novel IL-17 antagonist promotes heart graft survival[J].Transplant Proc,1999,31(1-2):93.

[9]Cooper AM,Khader SA.IL-12p40:an inherently agonistic cytokine[J].Trends Immunol,2007,28(1):33-38.

[10]Iwakura Y,Ishigame H.The IL-23/IL-17 axis in inflammation[J].J Clin Invest，2006,116(5):1218-1222.

[11]Langrish CL,Chen Y,Blumenschein WM,et al.IL-23 drives a pathogenic T cell population that induces autoimmune inflammation[J].J Exp Med,2005,201(2):233-240.

[12]熊俊杰,陸慧敏,杜曉炯,等.Th17細(xì)胞在胰島移植中的作用[J].四川大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2010,41(4):638-643.

[13]Schambach F,Schupp M,Lazar MA,et al.Activation of retinoic acid receptor-alpha favours regulatory T cell induction at the expense of IL-17-secreting T helper cell differentiation[J].Eur J Immunol,2007,37(9):2396-2399.