三七三醇皂苷對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的保護(hù)作用*

朱德淼 劉學(xué)政

糖尿病可誘導(dǎo)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（retinal gangli?on cell，RGC）凋亡，引發(fā)糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR），是成年人視力減退甚至失明的重要原因之一[1]。三七三醇皂苷（Panax notoginseng，PTS）是中藥三七的重要活性成分，可改善腦缺血所致的腦體積縮小及神經(jīng)功能缺損，有明顯的神經(jīng)保護(hù)作用[2-3]。本研究擬探討PTS對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜RGC的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 30只SD大鼠雌雄不限，體質(zhì)量200～230 g，購(gòu)自遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；PTS購(gòu)自成都華神集團(tuán)股份有限公司制藥廠；鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）、羊抗大鼠Nogo受體一抗、小鼠抗大鼠Brn3a一抗、A594-驢抗羊二抗及A488-驢抗小鼠二抗均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；MDA試劑盒購(gòu)自北京碧云天生物公司。

1.2 糖尿病模型的建立及實(shí)驗(yàn)分組 動(dòng)物隨機(jī)分為對(duì)照組、糖尿病組和治療組，每組10只。糖尿病組和治療組腹腔注射1%STZ溶液（60 mg/kg），48 h后尾靜脈取血測(cè)血糖，若大于16.7 mmol/L即為模型建立成功。治療組給予PTS 50 mg·kg-1·d-1灌胃給藥，每日2次。對(duì)照組及糖尿病組給予等劑量生理鹽水。1個(gè)月后進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)。

1.3 Nogo受體及Brn3a熒光免疫組化雙標(biāo) 快速摘除大鼠雙側(cè)眼球，于解剖顯微鏡下，以眼科剪沿角膜緣剪開(kāi)眼球，去除角膜、晶狀體及玻璃體，剝離視網(wǎng)膜，濾紙吸干后稱質(zhì)量。常規(guī)制備視網(wǎng)膜石蠟切片，脫蠟至水化。以羊抗大鼠Nogo受體/小鼠抗大鼠Brn3a一抗混合液于4℃孵育48 h，均稀釋為1∶200（Brn3a為RGC特異性標(biāo)志物），再以A594-驢抗羊/A488-驢抗小鼠二抗混合液孵育室溫4 h（均稀釋為1∶500），封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.4 Western blot檢測(cè)Nogo受體表達(dá) 將視網(wǎng)膜以4℃生理鹽水制備1%濃度組織勻漿。蛋白裂解液裂解后以12 000 r/min離心15 min，上清液以80 V電壓聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干法移至PVDF膜，以Nogo受體及β-actin一抗于37℃分別孵育2 h，再以辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫分別孵育1 h，試劑盒顯影。Nogo與β-actin條帶光密度值之比即為Nogo受體相對(duì)表達(dá)量。

1.5 視網(wǎng)膜丙二醛（MDA）含量檢測(cè) 以4℃生理鹽水制備5%的視網(wǎng)膜勻漿，4 000 r/min離心10 min后取上清，按試劑盒提供的操作步驟及公式，利用硫代巴比妥酸法檢測(cè)視網(wǎng)膜中MDA含量。

1.6 視網(wǎng)膜HE染色 常規(guī)制備視網(wǎng)膜石蠟切片，脫蠟入水，經(jīng)蘇木精染色、分色、水洗、乙醇伊紅染色液染色、乙醇逐級(jí)脫水及二甲苯透明等常規(guī)步驟，封片后鏡下觀察，每個(gè)視網(wǎng)膜隨機(jī)讀取3個(gè)視野，計(jì)數(shù)3次，取平均值，計(jì)算各組RGC密度。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血糖水平 造模48 h后，糖尿病組及PTS治療組血糖明顯高于對(duì)照組（均P＜0.001），糖尿病模型構(gòu)建成功，見(jiàn)表1。

Table 1 Comparison of blood glucose，expression of Nogo receptor,the level of MDA,and density of RGC between three groups表1 3組大鼠血糖、視網(wǎng)膜Nogo受體表達(dá)、MDA含量及RGC密度比較 （n=10，x±s）

2.2 Brn3a和Nogo受體表達(dá)情況 熒光免疫組化雙標(biāo)顯示，Brn3a與Nogo受體于視網(wǎng)膜內(nèi)大量共存，見(jiàn)圖1。

2.3 PTS對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜Nogo受體表達(dá)的影響 糖尿病組Nogo受體表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組和治療組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），見(jiàn)表1、圖2。

Figure 2 Expression levels of retinal Nogo receptor in three groups圖2 各組視網(wǎng)膜Nogo受體表達(dá)

2.4 PTS對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜MDA含量的影響 3組間MDA含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），糖尿病組高于對(duì)照組和治療組（均P＜0.001），見(jiàn)表1。

2.5 PTS對(duì)糖尿病大鼠RGC密度的影響 糖尿病組視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層RGC密度較對(duì)照組和治療組明顯減少（P＜0.001），見(jiàn)表1、圖3。

3 討論

糖尿病累及視網(wǎng)膜即發(fā)生DR，視網(wǎng)膜RGC受損是DR患者視力減退的重要原因[4]。糖尿病患者DR發(fā)病率高，即使嚴(yán)格控制血糖也不能完全防治DR，患者仍有視力減退甚至失明的危險(xiǎn)。糖尿病病程5年患者DR發(fā)病率約為44.4%，7年約為56%左右，10年約60%，15年則高達(dá)80%[5-6]。預(yù)計(jì)2030年全球糖尿病患者將達(dá)3億6千萬(wàn)[7]，DR已經(jīng)成為成年人致盲的重要因素[8]。

三七是一種傳統(tǒng)中藥，PTS是三七的重要活性成分之一。本研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠視網(wǎng)膜RGC數(shù)量明顯減少，給予PTS可恢復(fù)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜RGC數(shù)量，表現(xiàn)出了明顯的神經(jīng)保護(hù)作用。

PTS保護(hù)缺血腦神經(jīng)元的機(jī)制尚不完全清楚，可能與PTS抑制神經(jīng)元Nogo受體及其配體Nogo-A的表達(dá)，促進(jìn)腦缺血后的神經(jīng)再生有關(guān)[2-3]。Nogo受體是一種髓磷脂相關(guān)蛋白，可抑制神經(jīng)再生，在視網(wǎng)膜僅表達(dá)于RGC細(xì)胞內(nèi)[9]。本研究也發(fā)現(xiàn)，Nogo受體與Brn3a在視網(wǎng)膜內(nèi)大量共存，僅表達(dá)于視網(wǎng)膜RGC內(nèi)。青光眼時(shí)視網(wǎng)膜RGC細(xì)胞Nogo受體表達(dá)增加，抑制Nogo受體表達(dá)可抑制RGC細(xì)胞凋亡，Nogo受體表達(dá)增加是視網(wǎng)膜RGC凋亡的重要機(jī)制之一[10]。本研究結(jié)果顯示，PTS恢復(fù)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜RGC數(shù)量的同時(shí)，視網(wǎng)膜Nogo受體表達(dá)減少，提示下調(diào)Nogo受體表達(dá)可能是PTS保護(hù)糖尿病視網(wǎng)膜RGC的重要機(jī)制之一。

Nogo受體抑制細(xì)胞凋亡的機(jī)制復(fù)雜，可影響線粒體膜電位，是細(xì)胞氧自由基堆積，導(dǎo)致凋亡的重要因素之一[11]。因此，Nogo受體可能通過(guò)氧自由基堆積誘導(dǎo)RGC細(xì)胞凋亡。高血糖可誘發(fā)氧化應(yīng)激，MDA水平是氧化應(yīng)激的重要指標(biāo)之一。本研究表明，糖尿病時(shí)視網(wǎng)膜MDA水平增高，說(shuō)明糖尿病視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激明顯。PTS下調(diào)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜Nogo受體表達(dá)的同時(shí)，伴有視網(wǎng)膜MDA含量的降低，表明PTS下調(diào)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜Nogo受體表達(dá)的同時(shí)可降低視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激水平。因此，PTS可能通過(guò)下調(diào)RGC內(nèi)Nogo受體的表達(dá)，抑制RGC氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜RGC發(fā)揮保護(hù)作用。

本研究證實(shí)了PTS對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜RGC的保護(hù)作用，并研究了作用機(jī)制，為DR的臨床治療提供了思路，但DR發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，PTS在DR防護(hù)中的作用仍需深入探討。

Figure 1 Colocalization of Brn3a and Nogo receptor in retina(immunofluorescence histochemical double-staining×200)圖1 Brn3a與Nogo受體在視網(wǎng)膜內(nèi)的共存（熒光免疫組化雙標(biāo),×200）

Figure 3 Photos showing the number of RGC in three groups of diabetic rats(HE staining，×200)圖3 3組糖尿病大鼠RGC密度（HE染色，×200）

[1]Ola MS,Nawaz MI,Khan HA,et al.Neurodegeneration and neuro?protection in diabetic retinopathy[J].Int J Mol Sci,2013,14(2):2559-2572.

[2]朱陵群,王席玲,鄒憶懷,等.三七三醇皂苷對(duì)MCAO大鼠不同恢復(fù)時(shí)點(diǎn)Nogo-A和其受體NgR mRNA表達(dá)的影響[A].中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)腦病分會(huì)成立大會(huì)暨2008年全國(guó)中醫(yī)腦病學(xué)術(shù)研討會(huì)論文匯編,2008,181-185.

[3]翟建英,崔方圓,鄒蔚萌,等.三七三醇皂苷對(duì)腦梗死后不同時(shí)點(diǎn)Nogo-A表達(dá)的影響[J].中國(guó)中藥雜志,2008,33(4):470-473.

[4]Dong LY,Jin J,Lu G,et al.Astaxanthin Attenuates the Apoptosis of Retinal Ganglion Cells in db/db Mice by Inhibition of Oxidative Stress[J].Mar Drugs,2013,11(3):960-974.

[5]Malone JI,Morrison AD,Pavan PR,et al.Prevalence and signifi?cance of retinopathy in subjects with type 1 diabetes of less than 5 years'duration screened for the diabetes control and complications trial[J].Diabetes Care,2001,24(3):522-526.

[6]Nakajima M,Cooney MJ,Tu AH,et al.Normalization of retinal vas?cular permeability in experimental diabetes with genistein[J].In?vest Ophthalmol Vis Sci,2001,42(9):2110-2114.

[7]Wild S,Roglic G,Green A,et al.Global prevalence of diabetes:es?timates for the year 2000 and projections for 2030[J].Diabetes Care,2004,27(5):1047-1053.

[8]Silva PS,Cavallerano JD,Sun JK,et al.Effect of systemic medica?tions on onset and progression of diabetic retinopathy[J].Nat Rev Endocrinol,2011,6(9):494-508.

[9]Yin X,Chen C,Yuan R,et al.An immun of luorescence-histochemis?try study of the Nogo receptor in the rat retina during postnatal de?velopment[J].Ann Ophthalmol(Skokie),2007,39(2):140-144.

[10]Fu QL,Liao XX,Li X,et al.Soluble Nogo-66 receptor prevents syn?aptic dysfunction and rescues retinal ganglion cell loss in chronic glaucoma[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2011,52(11):8374-8380.

[11]Al-Shabrawey M,Smith S.Prediction of diabetic retinopathy:role of oxidative stress and relevance of apoptotic biomarkers[J].EPMA J,2010,1(1):56-72.