IL-17及RORγt在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎小鼠腦及脊髓組織中的動(dòng)態(tài)表達(dá)①

李 彬 劉 佳 李 茹 謝小華 王 穎 陳麗萍 郭 力

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 河北省神經(jīng)病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石家莊050000)

多發(fā)性硬化(Multiple sclerosis，MS)是一種以中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)脫髓鞘病變?yōu)樘攸c(diǎn)的自身免疫疾病。實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)是用同種或異種中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)抗原或特異性T淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)敏感動(dòng)物發(fā)生的主要累及中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘的自身免疫性炎癥，其臨床表現(xiàn)及病理變化和MS極其相似，是目前研究MS常用的動(dòng)物模型［1］。MS的發(fā)病機(jī)制尚無定論，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為MS是遺傳易感個(gè)體與環(huán)境因素作用而發(fā)生的自身免疫過程。既往研究多集中于Th1/Th2失衡對(duì)疾病的影響，然而新近研究發(fā)現(xiàn)，Th17/Treg平衡、IL-23/IL-17軸很可能在疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起著更為重要的作用［2，3］。本研究通過免疫組織化學(xué)及實(shí)時(shí)定量PCR方法觀察EAE小鼠腦和脊髓組織中IL-17及RORγt的動(dòng)態(tài)表達(dá)情況，探討IL-17及RORγt與EAE發(fā)生及發(fā)展的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組 將45只8～10周雌性C57BL/6小鼠，體重18～20 g，隨機(jī)分為對(duì)照組和EAE組。其中，對(duì)照組18只，EAE組27只。按照EAE病程發(fā)展，將EAE組分為發(fā)病前期(13天)，發(fā)病高峰期(20天)和緩解期(30天)3個(gè)亞組，每個(gè)亞組9只;空白對(duì)照組對(duì)應(yīng)于EAE的亞組分組每個(gè)亞組6只。

1.2 模型制備 將抗原MOG35-55用生理鹽水稀釋成6 mg/ml，并按1∶1等體積加入完全弗氏佐劑(其中結(jié)核桿菌H37Ra終濃度為4 mg/ml)混合，乳化后按每只0.1 ml于小鼠脊柱兩側(cè)分四點(diǎn)皮下注射，免疫當(dāng)天第0小時(shí)及第48小時(shí)腹腔注射500 ng PTX(百日咳毒素)。免疫當(dāng)天記為0天?？瞻讓?duì)照組18只，不作任何處理。

1.3 病情評(píng)估 采用雙盲法每日早晚(8∶00和16∶00)兩次對(duì)小鼠進(jìn)行稱重、評(píng)估，并進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分:0分:無任何臨床癥狀;1分:尾部張力消失，可見輕度步態(tài)笨拙;2分:雙后肢無力，被動(dòng)翻身后可以恢復(fù);3分:雙后肢癱瘓，被動(dòng)翻身后不能恢復(fù)，但給予刺激后可以挪動(dòng);4分:雙后肢癱瘓，前肢癱瘓或肌力減弱伴尿便失禁;5分:瀕死狀態(tài)或死亡。

癥狀介于兩者標(biāo)準(zhǔn)之間者以±0.5計(jì);“每日計(jì)分均值”由當(dāng)日組內(nèi)所有發(fā)病動(dòng)物分值總和除以該組發(fā)病動(dòng)物數(shù)量所得。

1.4 動(dòng)物處理 在動(dòng)物麻醉狀態(tài)下，于發(fā)病前期、高峰期及緩解期，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)EAE組取6只小鼠，對(duì)照組取3只小鼠，4%多聚甲醛灌流，取腦和脊髓腰膨大組織，進(jìn)行HE染色及免疫組織化學(xué)染色。于上述3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)正常對(duì)照組及EAE組各取3只小鼠，斷頭處死，在無菌的環(huán)境中迅速取出脊髓組織腰膨大部位，并置于-80℃冰箱以備Real-time PCR使用。

1.5 HE染色 石蠟切片機(jī)取5 μm厚度連續(xù)切片，每間隔100 μm取1張，每個(gè)組織取3張切片進(jìn)行常規(guī)HE染色。

將HE染色后的腦組織及脊髓組織切片于光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察，細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞漿呈淡紅色。以超過15～20個(gè)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)部位記為1個(gè)炎性灶。每只小鼠取3張腦組織及脊髓組織切片，計(jì)數(shù)每張切片的炎性病灶數(shù)，累計(jì)加和后除以3為每只小鼠平均炎性病灶數(shù)。

1.6 免疫組織化學(xué)染色 將石蠟切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色(SP法)。一抗為兔抗小鼠IL-17多克隆抗體，二抗為生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG，滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，DAB顯色，蘇木素液復(fù)染，鏡下觀察。

每只小鼠選擇腦組織及脊髓組織(相同部位)各3張組織片，每張組織片隨機(jī)選取3個(gè)視野，于10×40倍光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察，并對(duì)細(xì)胞核完整的免疫組化陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.7 Real-time PCR 取大約100 mg脊髓腰膨大組織，提取組織樣本中總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以合成的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。IL-17及RORγt引物序列見表1。根據(jù)Real-time PCR原始檢測(cè)結(jié)果，按照2-△△ct相對(duì)定量計(jì)算公式，計(jì)算mRNA相對(duì)水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)值用±s表示，兩組比較用t檢驗(yàn)，單因素多組比較用方差分析。神經(jīng)功能評(píng)分與炎癥細(xì)胞、炎癥因子間相關(guān)關(guān)系采用Pearson相關(guān)分析。P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EAE小鼠的發(fā)病情況及神經(jīng)功能評(píng)分 EAE組小鼠免疫后出現(xiàn)精神萎靡、食欲減退、皮毛不光滑、體重下降。于發(fā)病前期(13天)EAE組和對(duì)照組小鼠體重的均數(shù)分別為(19.81±1.81)克、(20.99±1.55)克，兩組比較EAE組小鼠體重顯著減輕(P＜0.05);EAE組小鼠平均發(fā)病時(shí)間為(14.42±4.12)天。第20天發(fā)病達(dá)高峰，EAE組全部發(fā)病，發(fā)病率為100%。此期癥狀最嚴(yán)重，小鼠出現(xiàn)雙后肢甚至四肢癱瘓及大小便失禁。EAE組的體重均數(shù)為(18.42±2.69)克，與對(duì)照組小鼠(22.87±1.99)克比較，EAE組小鼠體重明顯減輕(P＜0.05)。此期EAE組的神經(jīng)功能評(píng)分均數(shù)為2.38±0.52。第30天緩解期，小鼠逐漸出現(xiàn)體重上升，癥狀不同程度緩解，EAE組的體重均數(shù)為(20.87±1.43)克，與對(duì)照組小鼠(24.12±2.11)克相比，體重明顯減輕(P＜0.05)，但與高峰期相比，體重有所增加(P＜0.05)。此期EAE組小鼠神經(jīng)功能評(píng)分均數(shù)為1.78±0.67。

表1 IL-17及RORγt實(shí)時(shí)定量PCR引物序列Tab.1 IL-17 and RORγt oligonucleotide primers used for Real-time PCR

2.2 病理組織學(xué)觀察 光鏡下觀察HE染色的腦組織和脊髓，可見發(fā)病前期、發(fā)病高峰期及緩解期均有炎細(xì)胞浸潤(rùn)，在腦組織主要集中在腦膜下及腦室周圍白質(zhì);在脊髓組織主要集中在前角周圍白質(zhì)、灰白質(zhì)交界區(qū)及正中裂血管周圍，浸潤(rùn)細(xì)胞以淋巴細(xì)胞及中性粒細(xì)胞為主。EAE組于發(fā)病前期、高峰期、緩解期，腦及脊髓組織炎癥細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組均明顯增多(P＜0.05);EAE組內(nèi)，發(fā)病高峰期炎癥細(xì)胞數(shù)高于發(fā)病前期及緩解期(P＜0.05)。將EAE小鼠3個(gè)時(shí)期的發(fā)病情況(以神經(jīng)功能評(píng)分表示)與腦組織及脊髓組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況進(jìn)行相關(guān)性分析，Pearson相關(guān)系數(shù)分別為0.913、0.885，且 P＜0.05，二者呈正相關(guān)。見圖1、2。

圖1 EAE小鼠腦及脊髓組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況比較Fig.1 Inflammatory foci in the brain and spinal cord of EAE mice at different stage

2.3 各組小鼠腦及脊髓組織中IL-17表達(dá) 于光鏡下觀察，在腦和脊髓組織中發(fā)病前期、高峰期及緩解期均有IL-17陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)(IL-17主要表達(dá)于胞漿中，IL-17陽(yáng)性細(xì)胞表現(xiàn)為胞漿棕黃色顆粒，胞核由蘇木精染為藍(lán)色)。IL-17的表達(dá)部位在腦組織主要位于大腦白質(zhì)及灰白質(zhì)交界區(qū)的小血管周圍;在脊髓組織主要位于脊膜下白質(zhì)、灰白質(zhì)交界區(qū)及正中裂的血管周圍;表達(dá)細(xì)胞以炎癥細(xì)胞為主，神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞也有表達(dá)。EAE組3個(gè)時(shí)期與對(duì)照組相比，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增多(P＜0.05)。EAE組內(nèi)，發(fā)病高峰期較發(fā)病前期及緩解期陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增多(P＜0.05)。并且，從發(fā)病前期開始到發(fā)病高峰期，IL-17表達(dá)逐漸升高，進(jìn)入緩解期后IL-17的表達(dá)又有下降趨勢(shì)，腦及脊髓組織的上述變化與EAE小鼠的發(fā)病情況(以小鼠神經(jīng)功能評(píng)分反映)進(jìn)行相關(guān)性分析，Pearson相關(guān)系數(shù)分別為0.653、0.655，且 P ＜0.05，二者呈正相關(guān)。見圖3、4。

2.4 各組小鼠脊髓組織中 IL-17 mRNA、RORγt mRNA水平 EAE組發(fā)病前期、發(fā)病高峰期及緩解期IL-17mRNA水平較對(duì)照組明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);EAE組內(nèi)，發(fā)病高峰期較發(fā)病前期及緩解期IL-17 mRNA水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。IL-17 mRNA的表達(dá)量與小鼠神經(jīng)功能評(píng)分進(jìn)行相關(guān)性分析，Pearson相關(guān)系數(shù)為0.676，且P＜0.05，二者呈正相關(guān)。見圖5、6。

圖2 EAE小鼠腦及脊髓組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況與癥狀評(píng)分相關(guān)性分析Fig.2 The correlation between inflammatory foci in the brain or spinal cord and neurological deficit score in EAE mice

圖3 EAE小鼠腦及脊髓組織IL-17陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較Fig.3 IL-17 immunopositive cells in the brain and spinal cord of EAE mice at different stage

圖4 EAE小鼠腦及脊髓組織IL-17陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與癥狀評(píng)分相關(guān)性分析Fig.4 The correlation between IL-17 immunopositive cells in the brain or spinal cord and neurological deficit score in EAE mice

圖5 EAE小鼠脊髓組織IL-17 mRNA水平的動(dòng)態(tài)改變Fig.5 The dynamic expression of IL-17 mRNA in the spinal cord of EAE mice

EAE組發(fā)病前期、發(fā)病高峰期RORγt mRNA水平較對(duì)照組明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而發(fā)病緩解期RORγt mRNA水平與對(duì)照組比較升高趨勢(shì)不明顯，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。EAE組內(nèi)，發(fā)病高峰期較發(fā)病前期及緩解期RORγt mRNA水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見圖7。

圖6 EAE小鼠脊髓組織IL-17及RORγt mRNA水平與癥狀評(píng)分相關(guān)性分析Fig.6 The correlation between IL-17 or RORγt mRNA level in the spinal cord and neurological deficit score in EAE mice

圖7 EAE小鼠脊髓組織 RORγt mRNA水平的動(dòng)態(tài)改變Fig.7 The dynamic expression of RORγt mRNA in the spinal cord of EAE mice

3 討論

MS的病因及發(fā)病機(jī)制尚不十分明確。隨著研究的不斷深入，IL-23/IL-17軸在MS發(fā)生及發(fā)展中的重要意義，開始逐漸為人們所關(guān)注。MS患者表達(dá)IL-17的外周血單核細(xì)胞數(shù)量高于健康對(duì)照組，并且臨床癥狀加重期患者表達(dá)IL-17的單核細(xì)胞數(shù)量是緩解期患者的3.5倍;與外周血相比，MS患者腦脊液表達(dá)IL-17的單核細(xì)胞數(shù)量更多，提示MS患者IL-17表達(dá)水平增高，并且與疾病的嚴(yán)重程度有一定聯(lián)系［4］。再者，在EAE小鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中可檢測(cè)到大量產(chǎn)生IL-17的CD4+T細(xì)胞浸潤(rùn)，將此類細(xì)胞被動(dòng)轉(zhuǎn)輸給健康小鼠可以誘發(fā)嚴(yán)重的EAE，而抗 IL-17 治療可部分緩解 EAE［5］;Komiyama 等［6］發(fā)現(xiàn)，IL-17基因缺陷小鼠EAE的發(fā)生明顯受到抑制，表現(xiàn)為發(fā)病延遲且恢復(fù)更早，EAE嚴(yán)重程度評(píng)分和病理改變都明顯減輕;而將IL-17缺失的CD4+T細(xì)胞轉(zhuǎn)移到正常小鼠體內(nèi)并不能誘導(dǎo)EAE產(chǎn)生，提示IL-17在MS的發(fā)生過程中具有重要作用。因此，IL-17在MS(和EAE)的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用。

隨著EAE的發(fā)生、發(fā)展甚至緩解，腦及脊髓組織中IL-17在蛋白及基因水平的動(dòng)態(tài)改變?nèi)绾?，需要進(jìn)一步深入探究，這也正是本實(shí)驗(yàn)的研究方向及內(nèi)容。此外，孤兒核受體RORγt是掌管Th17細(xì)胞系分化的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子，并且對(duì)Th17細(xì)胞分泌IL-17也起著重要作用［7-9］。因此，本研究同時(shí)測(cè)定RORγt在基因水平的動(dòng)態(tài)表達(dá)，以期系統(tǒng)觀察IL-17及其上游調(diào)控因子與EAE病程的相關(guān)性。

通過本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在HE染色中，EAE小鼠在發(fā)病前期即有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，隨著癥狀的進(jìn)展及神經(jīng)功能缺損評(píng)分的增高，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度增加，而到緩解期炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)較發(fā)病高峰期有下降的趨勢(shì)。因此，EAE的發(fā)生及發(fā)展與炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)具有密切關(guān)系。同時(shí)，印證了免疫炎癥反應(yīng)在EAE病程中的重要作用，為進(jìn)一步研究IL-17的動(dòng)態(tài)表達(dá)與EAE病程的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。

免疫組化結(jié)果顯示，EAE組小鼠在發(fā)病前期、發(fā)病高峰期及緩解期IL-17陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與對(duì)照組比較均明顯升高，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明EAE的發(fā)生發(fā)展伴隨不同程度的IL-17表達(dá)的增加，提示IL-17與EAE存在重要聯(lián)系。而在EAE組中，EAE小鼠在發(fā)病前期IL-17表達(dá)即出現(xiàn)上調(diào)，早于臨床癥狀的發(fā)生，說明早在出現(xiàn)臨床癥狀之前就有IL-17相關(guān)的免疫反應(yīng)發(fā)生，進(jìn)一步說明了IL-17的產(chǎn)生對(duì)于EAE的發(fā)生具有重要作用。隨免疫后時(shí)間的延長(zhǎng)，IL-17表達(dá)呈逐漸增高趨勢(shì)。隨著EAE小鼠進(jìn)入癥狀高峰期，IL-17水平亦表現(xiàn)出較發(fā)病前期更為明顯的增加，說明IL-17的表達(dá)水平與EAE的病程發(fā)展有密切聯(lián)系。而恢復(fù)期IL-17表達(dá)水平出現(xiàn)下降。上述動(dòng)態(tài)變化經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性分析證實(shí)，IL-17表達(dá)與EAE的發(fā)生、發(fā)展及緩解呈顯著正相關(guān)。

此外，IL-17 mRNA及其重要調(diào)控因子 RORγt mRNA水平動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)與免疫組化結(jié)果相一致，從基因水平證實(shí)了IL-17隨EAE小鼠病情發(fā)展而動(dòng)態(tài)表達(dá)及IL-17在EAE中的重要作用。在緩解期RORγt mRNA表達(dá)量與對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，推測(cè)可能是由于IL-17在此期表達(dá)量較高峰期已經(jīng)明顯減少，而其調(diào)控因子對(duì)上述變化更加靈敏，減少的幅度較其下游調(diào)控產(chǎn)物IL-17更大。綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，表明IL-17的表達(dá)與EAE的發(fā)生、發(fā)展和緩解密切相關(guān)。

綜上所述，由于IL-17的動(dòng)態(tài)表達(dá)與EAE病程存在相關(guān)性，我們可以將調(diào)控IL-23/IL-17軸作為治療MS的重要靶點(diǎn)，為尋找有效干預(yù)藥物提供一個(gè)嶄新而重要的方向和途徑。

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